WWW.OS.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Научные публикации
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«В.И. Резяпкин ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Пособие по курсам «Молекулярная биология», «Основы молекулярной ...»

-- [ Страница 1 ] --

Министерство образования Республики Беларусь

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

«ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ»

В.И. Резяпкин

ПРИКЛАДНАЯ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Пособие

по курсам «Молекулярная биология»,

«Основы молекулярной биологии»,

для студентов специальностей:

1-31 01 01 – Биология, 1-33 01 01 – Биоэкология Гродно 2011 УДК 54(075.8) ББК 24.1 Р34 Рекомендовано Советом факультета биологии и экологии ГрГУ им. Я. Купалы.

Рецензенты:

Заводник И.Б., доктор биологических наук, доцент;

Буко В.У., доктор биологических наук, профессор.

Резяпкин, В.И.

Прикладная молекулярная биология : пособие / В.И. Резяпкин. – Р34 Гродно : ГрГУ, 2011. – 167 с.



ISBN 978-985-515-430-4 В книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии. Адресовано студентам специальностей: «Биология», «Биоэкология».

УДК 54(075.8) ББК 24.1 © Резяпкин В.И., 2011 © Учреждение образования «Гродненский государственный университет»

ISBN 978-985-515-430-4 имени Янки Купалы, 2011

ВВЕДЕНИЕ

Знания, полученные при изучении фундаментальных основ хранения, передачи и реализации генетической информации, на современном этапе развития науки нашли широкое применение в различных областях практической деятельности человека. С помощью методов, разработанных молекулярными биологами, созданы многочисленные живые организмы с измененным генетическим материалом, обладающие разнообразными полезными характеристиками. Разработаны многочисленные средства диагностики, широко применяемые в медицине, сельском хозяйстве, криминалистике и других сферах. Особый интерес представляют современные, основанные на принципах генотерапии, подходы профилактики и корректировки генетических заболеваний.

В предлагаемой книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии.

Пособие написано в соответствии с учебной программой по курсу «Молекулярная биология» для студентов специальностей: «Биология», «Биоэкология» и является продолжением ранее изданного пособия: «Основы молекулярной биологии» / В.И. Резяпкин. – Гродно: ГрГУ, 2010. – 220 с.

–  –  –

Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК является сложнейшей процедурой, так как эта молекула имеет громаднейшие размеры. Например, у цветковых растений размер гаплоидного генома может достигать до 1011 п.н. Несмотря на это исследователи придают большое значение установлению последовательности нуклеотидов ДНК, поскольку информация о первичной структуре ее молекулы или ее фрагмента позволяет судить о ее непосредственной функции в живом организме.

Определение первичной структуры ДНК осуществляют в несколько этапов.

Этап 1. Фрагментация ДНК с помощью рестриктаз.

В связи с тем, что в одном эксперименте можно определить последовательность ДНК, состоящую только из нескольких сотен пар нуклеотидов, ее молекулу предварительно фрагментируют. Для фрагментации ДНК обычно используют рестриктазы. Эти ферменты обладают специфичностью к первичной структуре ДНК и разрезают эту молекулу в строго определенных участках. При этом одна рестриктаза разрывает цепь ДНК в одних участках, другая – в других местах. Для фрагментации используют, как минимум, две различные рестриктазы. В результате их действия образуются перекрывающиеся фрагменты (рис. 1.1).

Этап 2. Определение нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов.

Существуют два принципиально отличающихся друг от друга подхода определения первичной структуры ДНК:

химический метод, разработанный А.Максомом и В.Гилбертом, и ферментативный метод, предложенный Ф.Сангером.

Последний метод наиболее распространен. Оба метода в настоящее время полностью автоматизированы, что значительно повысило эффективность определения первичной структуры ДНК.

–  –  –

Данный метод основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. В этом случае используются подходы, обеспечивающие выщепление определенного нуклеотида (либо по А, либо по Г, либо по Т, либо по Ц) и как следствие этого разрыв цепи ДНК. Определение первичной структуры ДНК осуществляют в 4 стадии.

Рис. 1.1. Схема, иллюстрирующая фрагментацию ДНК с помощью рестриктаз

Стадии 1. На этой стадии двухцепочечные ДНК разделяют с помощью денатурации.



Затем в 5’-конец цепи ДНК вносят метку (рис. 1.2).

Стадии 2. Анализируемый образец делят на 4 порции.

Каждую порцию подвергают химической обработке, в результате ДНК распадается на фрагменты различной длины  Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК (рис. 1.2) за счет статистического выщепления остатков Ц (порция 1), Т (порция 2), Г (порция 3), А (порция 4).

В результате фрагментации образуются фрагменты как несущие метку, так и не несущие. В каждой порции образуется несколько меченых фрагментов, отличающихся друг от друга размером. Число таких меченых фрагментов будет равно числу нуклеотидов, по которым осуществлялось расщепление. Если в первой порции расщепление проводили по Ц, а таких нуклеотидов в анализируемой цепи два, то и меченых фрагментов образовалось также 2 (рис. 1.2).

Стадии 3. На этой стадии проводят электрофорез полученных фрагментов (рис.

1.2). Скорость перемещения фрагментов обратно пропорциональна их длине. Чем короче фрагмент, тем с большей скоростью он перемещается. С помощью электрофореза можно разделить фрагменты, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид. По окончанию электрофореза по длине перемещения определяют размер в данном эксперименте только меченных с 5’-конца фрагментов.

Стадии 4. По результатам электрофореза меченых фрагментов определяют первичную структуру ДНК.

В первой порции, где расщепление проводили по Ц, выявлено два меченных фрагмента, состоящих из трех и шести нуклеотидов. Поскольку расщепление цепи осуществляли за счет статистического выщепления Ц, то этот нуклеотид в анализируемой цепи будет занимать положение 4 и 7.

Аналогично, по длине фрагментов, образующихся во 2-й порции, определяем положение Т в анализируемой цепи ДНК. Этот нуклеотид занимает 3 и 8 позиции. Подобным образом устанавливаем положения Г (6 и 10) и А (2, 5 и 9). Таким образом, устанавливается первичная структура неизвестной нуклеотидной последовательности ДНК.

–  –  –

Рис. 1.2. Установление первичной структуры ДНК с помощью метода А.Максома и В.Гилберта (химический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента. 1 – стадия 1, 2 – стадия 2, 3 – стадия 3, 4 – стадия 4 Метод Ф.Сангера (энзиматический метод) В его основе лежит принцип копирования анализируемой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Этот фермент осуществляет наращивание цепи ДНК в результате присоединения очередного дезоксинуклеотида к 3’-гидро

–  –  –

ксильной группе последнего дезоксинуклеотида. ДНКполимераза может использовать в качестве субстратов не только дезоксинуклеозидтрифосфаты, но и дидезоксинукл еозидтрифосфаты. У последних отсутствует гидроксильная группа в 3’-положении (рис. 1.3). Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывается, потому что в 3’-положении отсутствует гидроксильная группа, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен (рис. 1.4).

Рис.1.3. У дидезоксинуклеозидтрифосфата в отличие от дезоксинуклеозидтрифосфата гидроксильная группа в 3’-положении При определении первичной структуры ДНК по данному методу образец ДНК разделяют на четыре порции.

Во все порции добавляют:

• ДНК-полимеразу;

•дНТФ (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ);

•меченую затравку – олигонуклеотид, комплементарный 3’-концу анализируемой цепи ДНК.

Затем в первую порцию добавляют ддАТФ, во вторую – ддТТФ, в третью – ддЦТФ, в четвертую – ддГТФ.

Рассмотрим события, происходящие в первой пробе (рис. 1.5). Затравка гибридизуется с участком ДНК анализируемой цепи в области ее 3’-конца. После этого ДНКполимераза будет включать в растущую цепь нуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности. Напротив Т она может включить либо дАМФ, либо ддАМФ. Процесс включения является вероятностным. Если в растущую цепь ДНК включится ддАМФ, то синтез ДНК оборвется. Если же в растущую цепь ДНК включится дАМФ, то синтез ДНК будет продолжен. В результате в пробе будут содержаться  Прикладная молекулярная биология фрагменты вновь синтезированной цепи ДНК различной длины. При этом все они будут заканчиваться ддАМФ.

После денатурации двухцепочечной ДНК с помощью электрофореза определяют длину вновь синтезированных фрагментов. Если длина фрагментов ДНК равна 13, 18 и 23 нуклеотидам, следовательно, в 13, 18 и 23 положении фрагмента будет находится А, а в анализируемой цепи Т.

Аналогично определяют положение других нуклеотидов в анализируемой цепи ДНК. Таким образом, устанавливается первичная структура ДНК.

Рис. 1.4. Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывется, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Рис. 1.5. Установление первичной структуры ДНК с помощью метода Ф. Сангера и Д. Коулсона (энзиматический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента.

Этап 3. Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей.

После определения последовательности нуклеотидов фрагментов ДНК необходимо определить их очередность в интактной молекуле ДНК. Порядок их чередования устанавПрикладная молекулярная биология ливают на основании того, что фрагменты, полученные в результате разрезания разными рестриктазами, имеют идентичные фрагменты нуклеотидных последовательностей (рис. 1.6).

Рис. 1.6. Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей

–  –  –

Химический синтез ДНК В настоящее время разработаны методы химического синтеза как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и двухцепочечных ДНК. Синтез двухцепочечных ДНК осуществляют в два этапа. На первом этапе синтезируют одноцепочечные олигонуклеотиды с заданной последовательностью нуклеотидов. На втором этапе синтезированные олигонуклеотиды используются для конструирования протяженных двухцепочечных ДНК.

Используя данный подход, можно синтезировать гены или другие последовательности ДНК, применяемые в генетической инженерии, биотехнологии, в ДНК-диагностике инфекционных и генетических заболеваниях, для идентификации личности и др. В настоящее время процедура химического синтеза ДНК автоматизирована. Приборы, в которых осуществляется синтез ДНК, называются ДНК-синтезаторами.

Рассмотрим принцип метода, используемого для синтеза олигонуклеотидов (рис. 2.1). В начале этой процедуры первый мономер присоединяют к твердой фазе (нерастворимому носителю), который затем помещают в колонку-реактор. Далее через колонку пропускают второй мономер и другие химические реагенты. В результате второй мономер присоединяется к первому, образуя димер. Потом колонку промывают, с целью удаления непрореагировавших реагентов и побочных продуктов реакции. На этом завершается первый цикл. Затем осуществляют следующий цикл, пропуская через колонку очередной мономер.

Циклы многократно повторяют до завершения синтеза олигонуклеотида с заданной первичной структурой. После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от твердой фазы и подвергают очистке. Полученные олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве зондов при ДНКдиагностике, в качестве праймеров при секвенировании ДНК, а также для синтеза генов и др.

–  –  –

Рис. 2.1. Схема синтеза олигонуклеотида. N – азотистое основание, 1 – присоединение первого мономера к твердой фазе, 2 – присоединение второго мономера, 3 – присоединение третьего мономера, 4 – отделение олигонуклеотида от твердой фазы Олигонуклеотиды могут быть использованы для синтеза двухцепочечных ДНК. Стратегии синтеза коротких и протяженных двухцепочечных ДНК отличаются. Для получения коротких двухцепочечных молекул (60 – 80 п.н.) вначале синтезируют комплементарные цепи, которые затем подвергают гибридизации (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Схема синтеза коротких двухцепочечных молекул ДНК

–  –  –

В случае синтеза более протяженных двухцепочечных ДНК (более 300 п.н.) применяют другие подходы. Необходимость их использования связана с тем, что при химическом синтезе олигонуклеотидов происходят ошибки, в результате которых синтез протяженного олигонуклеотида сопровождается крайне низким выходом. В связи с этим длинные двухцепочечные ДНК собирают из коротких одноцепочечных фрагментов, размер которых составляет 20 – 100 нуклеотидов. Сборку двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных фрагментов можно осуществлять разными способами. Один из способов подразумевает получение набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.3). Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК.

Имеющиеся в ее молекуле одноцепочечные разрывы далее сшивают с помощью ДНК-лигазы. Другой подход, используемый для синтеза протяженных двухцепочечных ДНК, также подразумевает синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.4). Однако после гибридизации таких фрагментов в молекуле ДНК образуются большие бреши. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНК-полимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНКлигазы.

1 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.3. Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с разрывами, которые сшивают с помощью ДНК-лигазы Рис. 2.4. Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с брешами. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНКполимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНК-лигазы 1 Глава 2. Синтез ДНК Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Суть метода ПЦР заключается в многократном копировании определенного участка ДНК. В течение нескольких часов с помощью этого метода можно получить более 50 млрд. копий специфических нуклеотидных последовательностей (рис. 2.5). Этот метод широко используют для синтеза генов. Однако только этим применение ПЦР не ограничивается.

Рис. 2.5.

В результате ПЦР можно получить множество копий специфических последовательностей ДНК При проведении ПЦР в реакционную смесь добавляют следующие компоненты:

•ДНК-матрицу, содержащую тот участок ДНК (ДНКмишень), который требуется амплифицировать;

• праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды (15 – 30 нуклеотидов), комплементарные концевым участкам ДНК-мишени и способные с ними образовывать гибриды (рис. 2.6);

• Tag-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая реакцию полимеризации ДНК и выдерживающая нагревание до 95 °С;

• дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) – субстраты для синтеза ДНК.

–  –  –

Рис. 2.6. Праймеры – олигонуклеотиды, комплементарные концевым участкам ДНК-мишени. После плавления ДНК и последующего отжига они способны с последними образовывать гибриды. Р1 и Р2 – праймеры При проведении ПЦР осуществляют многократное повторение циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурация, отжиг и элонгация. Рассмотрим подробнее эти стадии.

• Денатурация. На этой стадии реакционную смесь, содержащую все компоненты, необходимые для ПЦР, нагревают до 92 – 95 °С, в результате происходит плавление ДНК и ее цепи расходятся (рис. 2.7).

• Отжиг. Реакционную смесь охлаждают приблизительно до 55 °С, при этом праймеры гибридизуются с комплементарными последовательностями ДНК (рис. 2.7).

• Элонгация. Температуру реакционной смеси на этой стадии повышают приблизительно до 75 °С, поскольку активность Tag-полимеразы в таких условиях оптимальна.

ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК (рис. 2.7).

На рис. 2.7 показаны события, происходящие на первом цикле ПЦР. Как видно из рисунка после первого

–  –  –

цикла длина каждой из синтезированных цепей ДНК больше длины нуклеотидной последовательности ДНК-мишени.

Таким образом, на этой стадии не происходит образования первой копии фрагмента ДНК, который требуется получить в результате амплификации.

Рис. 2.7. События, происходящие на первом цикле ПЦР. Р1 и Р2 – праймеры Первая же копия фрагмента амплификации образуется только после третьего цикла ПЦР (рис. 2.8). Для получения большого количества копий фрагмента амплификации цикл повторяется 30 – 35 раз. На рис. 2.9 показаны события, осуществляющиеся при протекании поздних циклов ПЦР.

В это время в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени.

Каждый цикл длится около 3 – 5 мин. К концу 30 цикла число копий превышает 106. ПЦР является высокочувствительным методом, позволяющим при наличии ничтожного количества ДНК в пробе получить огромное число копий интересующих исследователя фрагментов ДНК.

–  –  –

ПЦР в настоящее время широко используют для проведения различных видов анализа. Во многих случаях в анализируемых образцах требуется выявить наличие определенных последовательностей ДНК. Например, при идентификации патогенных микроорганизмов в биологических объектах достаточным является выявление ДНК этого возбудителя в исследованных образцах. С этой целью может быть использован ПЦР-анализ.

ПЦР-анализ проводят в три стадии. На первой стадии осуществляют подготовку образцов ДНК. Они могут быть выделены из любого биологического объекта. На второй стадии осуществляют амплификацию специфических нуклеотидных последовательностей. В этом случае необходимо использовать праймеры, комплементарные к искомой ДНК. Если в исследуемом образце присутствует искомая ДНК, то праймеры в процессе отжига будут с Глава 2. Синтез ДНК ней гибридизоваться и Tag-полимераза сможет начать синтез ДНК. Тогда в результате ПЦР будут синтезированы многочисленные копии фрагмента амплификации. При отсутствии искомой ДНК в исследуемых образцах праймеры не будут гибридизоваться с ДНК и не смогут выступать в качестве затравки для полимеразы. Синтез ДНК не будет осуществляться.

На третьей стадии посредством электрофореза в агарозном геле выявляют наличие или отсутствие в реакционной смеси продукта амплификации (рис. 2.10). При наличии продукта амплификации делается заключение о том, что в исследуем образце присутствует искомая ДНК.

Рис. 2.9. При протекании поздних циклов ПЦР в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени.

Р1 и Р2 – праймеры

–  –  –

Рис. 2.10. Выявление наличия или отсутствия в реакционной смеси продукта амплификации посредством электрофореза в агарозном геле.

Стрелкой указано направление электрофореза. 1 – положительный контроль, 2 – отрицательный контроль, 3 – отрицательный образец, 4 – положительный образец ПЦР-анализ нашел и находит применение в различных областях: при диагностике инфекционных, генетических и онкологических заболеваний, диагностике патогенов в пищевых продуктах, диагностике генетически модифицированных продуктов, идентификации личности и т.д.

При диагностике инфекционных заболеваний используются праймеры, специфичные к участкам ДНК потенциального возбудителя, но не пациентов. При наличии ДНК возбудителя в биологических образцах, полученных от больного, ПЦР-анализ даст положительный результат, при отсутствии такой ДНК – отрицательный. Таким образом, на основании ПЦР-анализа можно сделать вывод о причине заболевания. ПЦР-анализ позволяет выявить возбудителя заболевания в очень низкой концентрации.

Соответственно, при диагностике генетических и онкологических болезней используются праймеры, специфичные к генам, обуславливающим данные заболевания. А при диагностике патогенов в пище используются праймеры, специфичные к ДНК патогенов.

Глава 2. Синтез ДНК ПЦР с обратной транскрипцией Геномы многих вирусов представлены РНК.

В их жизненных циклах может отсутствовать промежуточная фаза превращения РНК в ДНК. В связи с этим при выявлении РНК таких вирусов ее необходимо перевести в форму ДНК. Для этого используют термостабильную обратную транскриптазу (ревертазу) – фермент, использующий в качестве матрицы одноцепочечную РНК для синтеза двухцепочечной ДНК.

При проведении обратной транскрипции в реакционной среде должны присутствовать праймеры и дНТФ. После обратной транскрипции полученная комплементарная ДНК (кДНК) может быть амплифицирована с помощью ПЦР (рис. 2.11).

–  –  –

ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять детекцию продуктов амплификации во время проведения эксперимента. Этот метод исключает стадию электрофореза, что способствует существенному сокращению продолжительности эксперимента. Накопление продуктов ПЦР пропорционально числу копий исследуемой ДНК (или РНК) в анализируемом образце. В связи с этим возможно количественное определение ДНК или РНК.

Существует множество подходов регистрации продуктов амплификации в процессе ПЦР. Рассмотрим один из таковых, получивший название «Выщепление 5’-концевой метки» (рис. 2.12). При использовании этой методики в реак-ционную смесь добавляют ДНК-зонды, содержащие на 5’-конце флуоресцентную метку (флуорофор), а на 3’-конце – гаситель флуоресценции. ДНК-зонды комплементарны участку амплификации. В ходе ПЦР на стадии отжига ДНКзонды присоединяются к участку амплификации. В таком состоянии гаситель поглощает излучение, испускаемое флуоресцентной меткой. На стадии элонгации ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, начинает синтез комплементарной цепи ДНК в направлении ДНКзонда. При его достижении благодаря 5’-экзонуклеазной активности этот фермент выщепляет флуорофор. В результате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что сопровождается свечением. Интенсивность свечения с каждым циклом ПЦР будет усиливаться. В то же время интенсивность свечения будет зависеть и от числа копий анализируемых ДНК в образце. Чем интенсивнее свечение, тем больше число копий. Таким образом, по интенсивности свечения можно судить о количественном содержании анализируемой ДНК в исследуемых пробах.

–  –  –

Рис. 2.12. Регистрация продуктов амплификации в процессе ПЦР в реальном времени при использовании методики «Выщепление 5’-концевой метки»

2 Глава 3. ДНК-ДИАГНОСТИКА Первичная структура ДНК индивидуумов, относящихся к одному или различным видам живых существ, в определенной степени уникальна. На этой особенности основана ДНК-диагностика. Последняя включает группу методов, позволяющих установить истину в результате исследования ДНК. Сегодня ДНК-диагностика нашла широкое применение при выявлении возбудителей инфекционных заболеваний, обнаружения генетических заболеваний, установлении биологического родства, идентификации личности и т.д.

Образцы ДНК для исследования могут быть выделены из любого биологического материала: из крови, волоса, мочи, мокроты, соскоба с внутренней стороны щеки или мочеиспускательного канала и т. п. Оказываются пригодными для ДНК-диагностики биологические образцы, сохраняющиеся в течение сотен и тысяч лет. Количество ДНК, необходимое для проведения анализа может быть ничтожно малым. Возможно успешная диагностика, даже если в образце имеется только одна молекула ДНК. ДНК-диагностика является не только чрезвычайно чувствительным методом, но высокоточным. Ее точность приближается к 100 %.

При ДНК-диагностике широко используется метод ПЦР. Его принцип и применение были рассмотрены в предыдущей главе. ПЦР может быть применен при анализе ДНК в сочетании с другими подходами. Об этом поговорим подробнее в следующих разделах. В то же время многие диагностические методы основаны на использовании меченых гибридизационных зондов, комплементарных к искомой молекуле ДНК.

ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов Этот метод основан на использовании гибридизационных зондов, комплементарных к искомым последовательностям ДНК. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК. Они

–  –  –

могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов). Они могут представлять собой продукт химического синтеза или являться клонированными копиями интактных генов или их фрагментов. Гибридизационный зонд должен быть высокоспецифичным, т.е.

он должен спариваться только с искомой нуклеотидной последовательностью. Кроме того зонд должен содержать радиоактивную (или нерадиоактивную) метку.

Последовательность действий при данном методе диагностики следующая (рис.

3.1):

• получение образца ДНК из биологического объекта;

• денатурация ДНК;

• фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре;

• нанесение на фильтр меченого одноцепочечного ДНКзонда, который при определенных условиях гибридизуется с ДНК-мишенью;

• промывание фильтра для удаления избытка не связавшейся меченой ДНК-зонда;

• детекция гибридных молекул зонд/мишень.

–  –  –

Выявление на последней стадии эксперимента гибридных молекул зонд/мишень свидетельствует о наличии искомой ДНК в исследуемой пробе. Об отсутствии таковой ДНК в анализируемой пробе позволяет судить отрицательный результат детекции. Таким образом, с помощью меченого зонда можно выявить (или не выявить) определенные последовательности ДНК в образце и на основании этого сделать соответствующий вывод.

В качестве гибридизационных зондов часто используют зонды, меченные радиоактивным изотопом 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и в связи с этим легко детектируются. Радиоактивную метку на фильтре после удаления несвязавшегося зонда выявляют с помощью радиоавтографии. Однако, радиоактивно меченые зонды несут определенную экологическую опасность.

По этой причине в настоящее время все чаще используют зонды, меченные другим способом. Нашли широкое применение зонды, меченые биотином. Последовательность действий при использовании таких зондов следующая (рис.

3.2):

• гибридизация зонда, меченного биотином, с ДНКмишенью;

• удаление промыванием избытка несвязавшегося зонда;

• добавление авидина (белка куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина), эти белки имеют несколько центров сродства к биотину, и благодаря им связываются с биотинилированным зондом;

• добавление связанного с биотином фермента.

Обычно для этих целей используют щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. Биотинилированный фермент связывается с сайтом связывания биотина, расположенном в молекуле стрептавидина (или авидина);

• добавление субстрата, который под действием используемого фермента превращается в окрашенный или хемилюминесцентный продукт;

• регистрация изменения окраски либо люминесценции.

Нерадиоактивные зонды не только более экологичны, чем радиоактивные, но и более стабильны. Долговечность

–  –  –

зондов меченных Р ограничена быстрым распадом радиоактивного изотопа, период полураспада 32Р составляет 14,3 суток. Биотинилированные же зонды стабильны не менее чем год. В то же время нерадиоактивные зонды по чувствительности не уступают радиоактивным.

Рис. 3.2. ДНК-диагностика с использованием гибридизационного зонда, меченого биотином. Б – биотин, С – стрептавидин, ЩФ – щелочная фосфатаза Еще одним методом нерадиоактивной детекции является подход, основанный на использовании зонда – «молекулярного маяка» (рис. 3.3). Этот зонд состоит из нескольких десятков нуклеотидов. Нуклеотиды, расположенные во внутренней части зонда, комплементарны ДНК-мишени.

Нуклеотиды же, находящиеся на концах зонда, взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5’-концу зонда присоединен флуорофор, испускающий излучение, а к 3’-концу – тушитель, поглощающий испускаемое флуорофором излучение. После гибридизации зонда – «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью, происходит пространственное разобщение флуорофора и тушителя, и зонд начинает испускать свет. Испускаемое свечение свидетельствует о том, что между зондом и ДНК-мишенью произошла гибридизация (рис. 3.3).

–  –  –

Рис. 3.3. В результате гибридизации зонда – «молекулярного маяка»

с ДНК-мишенью наблюдается флуоресценция ДНК-фингерпринтинг ДНК-фингерпринтинг (или геномная дактилоскопия) применяется для генетической идентификации личности, установления отцовства и в криминалистике.

Последовательность процедур при использовании метода ДНК-фингерпринтинга следующая:

• подготовка образца крови или ткани;

• выделение ДНК из образца;

• фрагментация ДНК рестриктазой;

• электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле;

• перенос ДНК из геля на мембрану;

• гибридизация на мембране ДНК с одним или несколькими зондами, комплементарными определенным нуклеотидным последовательностям. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК;

• отмывка избытка меченого зонда;

• выявление полос гибридизации;

• анализ полученного результата.

0 Глава 3. ДНК-диагностика Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов различно (рис. 3.4), но для разных тканей одного и того же индивидуума, оно остается постоянным и не зависит от возраста. В связи с этим данный метод может быть использован для создания ДНК-паспортов, которые представляют собой спектр распределения гибридизационных полос, полученный рассмотренным выше методом. Этот спектр остается постоянным на протяжении всей жизни, поэтому ДНК-паспорт нельзя потерять и его нельзя подделать.

Рис. 3.4. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов, 1, 2, 3 – образцы ДНК, полученные от различных индивидуумов ДНК-фингерпринтинг используется в судебной медицине для идентификации личности. Сравнивая полученные методом ДНК-фингерпринтинга результаты анализа ДНК подозреваемого и ДНК, выделенной из биологических образцов (крови, спермы, кусочка кожи, волос и т.д.) с места преступления, можно сделать вывод о причастности подозреваемого к преступлению (рис. 3.5). Если спектры гибридизационных полос при анализе ДНК подозреваемого

–  –  –

и ДНК образцов с места преступления совпадают, то можно с высокой долей вероятности судить о причастности подозреваемого к преступлению. Если же спектры не совпадают, то эти данные свидетельствуют о непричастности подозреваемого к преступлению.

Рис. 3.5. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК, выделенной из биологического образца с места преступления (БО) и из тканей подозреваемого 1 (П1) и подозреваемого 2 (П2). Совпадение спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, с таковым подозреваемого 2 свидетельствует о причастности его к преступлению. Отличие спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, от такового подозреваемого 1 свидетельствует о его непричастности к преступлению ДНК-фингерпринтинг может быть применен для установления отцовства. Поскольку распределение полос гибридизации наследуется по законам Менделя, то потомки от матери и отца наследуют по половине полос. Сравнивая полученные результаты ДНК-анализа предполагаемого отца, матери и ребенка можно определить является ли предполагаемый отец биологическим отцом или нет (рис. 3.6).

2 Глава 3. ДНК-диагностика Рис. 3.6. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК матери (М), ребенка (Р) и двух предполагаемых отцов. Из анализа результатов следует, что ребенок унаследовал половину полос от матери и половину полос от П1.

Следовательно, он и является биологическим отцом Диагностика инфекционных заболеваний В настоящее время зонды широко используются для диагностирования инфекционных заболеваний. В качестве зондов, используются нуклеотидные последовательности, комплементарные к ДНК возбудителя, но не к ДНК человека или к ДНК организмов, которые могут присутствовать в биообразцах взятых для ДНК-диагностики. При этом предпочтительно использовать зонды, комплементарные к высокоповторяющимся последовательностям ДНК возбудителя, что значительно повышает чувствительность метода диагностирования. Получены и охарактеризованы более сотни ДНК-зондов, позволяющих идентифицировать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших.

ДНК-диагностика генетических заболеваний ДНК-диагностика генетических болезней позволяет на уровне ДНК идентифицировать ту или иную патологию.

На основании ДНК-теста можно сделать вывод о том,

–  –  –

что причиной заболевания являются или не являются нарушения в организации ДНК. Многие наследственные заболевания проявляются не сразу, а по прошествии довольно продолжительного времени. ДНК-диагностика же позволяет выявить болезнь, когда еще признаки заболевания не проявились. В связи с этим ДНК-диагностика в раннем возрасте позволит заблаговременно предпринять определенные меры при лечении данного заболевания. Кроме того, используя ДНК-диагностику, можно выявить носителей «дефектных» генов, и в последствие на основании диагноза планировать семью. Возможна ДНК-диагностика до рождения. В этом случае ДНК плода выделяют из хориона, пуповины или омниотической жидкости. Более того, возможна преимплантационная ДНК-диагностика. В этом случае яйцеклетки оплодотворяют in vitro. Из зародыша на стадии 8 клеток извлекают 1 или 2 клетки и анализируют их ДНК на наличие поврежденного гена. Зародыш, содержащий неповрежденный ген, имплантируют в матку.

Гены, вызывающие генетические заболевания, отличаются от нормальных генов первичной структурой. Причиной генетического заболевания может являться также и нарушение в регуляции экспрессии генов или же отсутствие самих генов. Обнаружить такие заболевания можно, выявив отличия в организации дефектного гена от нормального.

ДНК-диагностика генетических заболеваний с использованием гибридизационных зондов Диагностировать генетические заболевания можно с помощью гибридизационных зондов. С этой целью из клеток больного выделяют ДНК. Затем ее фрагментируют, используя рестриктазу. Полученные фрагменты разделяют с помощью электрофореза. Далее фрагменты переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На фильтр наносят зонд, несущий радиоактивную метку. В качестве зонда могут быть использованы последовательности ДНК, комплементарные дефектному или нормальному гену. Зонд при наличии комплементарных последовательностей в исследуемой ДНК,  Глава 3. ДНК-диагностика гибридизуется с ней, при отсутствии – не гибридизуется.

После отмывки не связавшегося зонда методом авторадиографии выявляют наличие полосы гибридизации.

Если при использовании зонда, комплементарного к дефектному гену, полоса гибридизации не выявляется (рис. 3.7), это свидетельствует об отсутствии дефектного гена в исследуемом образце ДНК пациента. На основании этих результатов, можно сделать вывод о том, что у пациента не обнаружено диагностируемое генетическое заболевание. Если же гибридизационная полоса выявляется, то делается вывод о том, что пациент является носителем дефектного гена.

Рис. 3.7. Идентификация генетического заболевания с помощью гибридизационного зонда, комплементарного дефектному (но не нормальному) гену.

Наличие полосы гибридизации при анализе образца ДНК свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (1), является носителем дефектного гена. Отсутствие полосы гибридизации свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (2), не является носителем дефектного гена Гибридизацию меченого зонда с ДНК можно проводить на хромосомных препаратах. В этом случае меченый зонд наносят на препараты специально приготовленных метафазных хромосом. После отмывки не связавшегося зонда выявляют места локализации последовательностей ДНК, комплементарных используемому зонду. Выявление таких мест осуществляют в случае использования радиоактивной

–  –  –

метки, посредством нанесения светочувствительной эмульсии на препараты хромосом, при использовании же биотинмеченных или флюоресцирующих ДНК-зондов посредством проведения соответствующей обработки препаратов.

ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии Серповидноклеточная анемия – генетическое заболевание, причиной которого является замена одного нуклеотида в -глобиновом гене (А заменяется на Т). В результате такой замены мутантный гемоглобин перестает эффективно транспортировать кислород. С заменой одного нуклеотида в

-глобиновом гене связано исчезновение сайта узнавания для рестриктазы Cvn1. Этот фермент распознает нуклеотидную последовательность CCTGAGG, которая в результате мутации превращается в последовательность ССТGTGG.

Последнюю указанная рестриктаза не способна узнавать, и соответственно, не способна разрезать ДНК в этом участке.

В процессе ДНК-анализа на наличие мутантных генов с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент -глобинового гена (рис. 3.8). Такой фрагмент нормального гена содержит 3 сайта узнавания рестриктазы Cvn1, мутантного же – на один меньше, т.е. 2 сайта. Амплифицированные фрагменты на следующей стадии обрабатывают рестриктазой Cvn1, в результате фрагмент, амплифицированный с нормального гена, расщепляется на 4 более мелких фрагмента ДНК, а фрагмент, амплифицированный с мутантного гена, – на 3 (рис. 3.8). Продукты рестрикции далее разделяют с помощью электрофореза. На электрофореграмме после окраски ДНК определяют число полос. Если анализировалась ДНК индивидуума, гомозиготного по нормальному гену (АА), то на электрофореграмме будут выявлены 4 полосы. При анализе ДНК индивидуума, гомозиготного по мутантному гену (SS), на электрофореграмме будут обнаружены 3 полосы. В случае же анализа ДНК индивидуумов, гетерозиготных по данному гену (АS), на электрофореграмме будут выявлены 5 полос (рис. 3.8).

–  –  –

Рис. 3.8. ДНК-анализ, направленный на выявление мутантного

-глобинового гена.

АА – гомозиготность по нормальному -глобиновому гену, SS – гомозиготность по мутантному -глобиновому гену, АS – гетерозиготность

–  –  –

Обнаружение однонуклеотидных замен с использованием методов ПЦР и лигирования олигонуклеотидных зондов (ПЦР/ЛОЗ) Метод ПЦР/ЛОЗ используется для идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов. Предположим, что нормальный ген отличается от мутантного тем, что в определенном участке вместо пары АТ в нормальном гене в мутантном гене находится ГЦ-пара. При анализе методом ПЦР/ЛОЗ с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент исследуемого гена, содержащий пару нуклеотидов, по кото-рой отличается нормальный и мутантный ген (рис. 3.9).

Рис. 3.9. Амплификация методом ПЦР фрагментов нормального и мутантного генов, отличающихся одной парой нуклеотидов Полученные в результате амплификации фрагменты гибридизуют с двумя зондами (рис. 3.10). При отжиге этих зондов с фрагментом нормального гена происходит их полная гибридизация. При этом 3’-конец зонда-1 гибридизуется с нуклеотидом (Т), который в мутантном гене заменен на Ц. А 5’-конец зонда-2 образует комплементарное взаимодействие с нуклеотидом, примыкающим к Т. В случае фрагмента мутантного гена 3’-концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным нуклеотиду Ц (рис. 3.10). К зонду-1 присоединен биотин, а к зонду-2 – дигоГлава 3. ДНК-диагностика ксигенин. При добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент нормального гена, зонды-1 и 2 ковалентно сшиваются. В то время как при добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент мутантного гена, этого не происходит, т.к. 3’-концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным соответствующему нуклеотиду (рис. 3.10). После обработки лигазой проводят денатурацию ДНК, в результате которой происходит высвобождение зондов. Затем содержимое проб переносят в пластиковые лунки, покрытые стрептавидином. С последним связываются меченные биотином зонды (рис. 3.10). После связывания лунки промывают с целью удаления не связавшегося материала. Затем в них добавляют соединенные со щелочной фосфатазой антитела к дигоксигенину. Антитела при наличии дигоксигенина взаимодействуют с ним, образуя комплекс, содержащий в своем составе щелочную фосфатазу (рис. 3.10). Для удаления не связавшегося материала лунки снова промывают. После этой процедуры в них добавляют субстрат. При наличии щелочной фосфатазы субстрат превращается в окрашенный продукт (рис. 3.10). Появление окраски в лунке свидетельствует о связывании антитела с зондом, меченным дигоксигенином, и, следовательно, о том, что произошло лигирование зонда-1 и зонда-2. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что анализу в этом случае подвергся нормальный ген. Если же окрашивания не произошло (рис. 3.10), значит, лигирования не было. Анализу в этом случае подвергся мутантный ген.

Метод ПЦР/ЛОЗ является высокоэффективным и высокоспецифичным методом. Все его стадии автоматизированы.

–  –  –

Рис. 3.10. Идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов метод ПЦР/ЛОЗ. Б – биотин, Д – дигоксигенин, АТ – антитело, ЩФ – щелочная фосфатаза

–  –  –

Идентификация мутаций в разных участках одного гена с помощью нескольких гибридизационных зондов Многие генетические заболевания связаны с мутациями в разных участках одного и того же гена. Такие мутантные гены отличаются от нормального гена и между собой нуклеотидными заменами в определенных сайтах. В свою очередь от комбинации мутантных и нормальных генов в геноме индивидуумов зависит проявление генетического заболевания. В связи с этим крайне важным для коррекции патологии является установление генетического статуса больного.

С целью идентификации в разных сайтах гена мутаций синтезируют набор специфических зондов, каждый из которых комплементарен фрагменту гена, несущему известную мутацию. К 3’-концу каждого зонда присоединяют poly(dT) (около 400 нуклеотидов), с помощью которых ДНКзонды связываются с определёнными точками на мембране (рис. 3.11). Далее амплифицированные с помощью ПЦР и помеченные биотином фрагменты анализируемого гена (каждый из которых содержит по одному мутантному сайту) гибридизуют с зондами, пришитыми к мембране (рис. 3.11).

Затем добавляют стрептавидин, связанный с ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). Там, где произошла гибридизация фрагмента мутантного гена с зондом, стрептавидин связывается с биотином, образуя комплекс, состоящий из зонда, фрагмента мутантного гена, биотина, стрептавидина и фермента (рис. 3.11).

Мембрану промывают, и добавляют неокрашенный субстрат, который под действием фермента превращается в окрашенный продукт (рис. 3.11). На точке фильтра, где наблюдается окрашивание, имеет место соответствие между амплифицированным фрагментом мутантного гена и специфическим зондом. Что свидетельствует о наличии соответствующего мутантного сайта в анализируемом гене.

Таким образом, проанализировав результаты эксперимента, можно идентифицировать наличие мутантных сайтов в гене.

–  –  –

Рис. 3.11. Идентификация мутаций в разных участках одного гена.

Б – биотин, С – стрептаведин, ЩФ – щелочная фосфатаза Идентификация биологических останков с использованием молекулярно-генетического анализа с целью выявления их принадлежности к определенной семье Идентификацию костных останков с целью установления их принадлежности к определенной семье можно проводить в 3 этапа:

• установление половой принадлежности останков;

• выявление генетического родства между индивидуумами, останки которых исследуются;

2 Глава 3. ДНК-диагностика

• установление принадлежности выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье.

Рассмотрим подробнее все эти этапы. Предположим, что поставлена задача проанализировать костные останки десяти человек: выявить их половую пренадлежность, установить или опровергнуть генетическое родство между индивидуумами, останки которых обнаружены, и установить принадлежность выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье.

Определение половой принадлежности останков может быть осуществлено по анализу организации гена амелогенина – белка зубной эмали. Этот ген локализован в половых хромосомах X и Y. Ген амелогенина в Y-хромосоме оказывается на 6 п.н. длиннее, чем в X-хромосоме. После выделения ДНК из костных останков получают с помощью ПЦР фрагменты генов амелогенина. При этом фрагмент гена Y-хромосомы состовляет 112 п.н., а Х-хромосомы – 106 п.н.

Поскольку у мужчин присутствуют X и Y хромосомы, то в результате ПЦР образуются оба фрагмента. У женщин присутствует только X хромосома, поэтому у них образуется только один фрагмент, размером 106 п.н. Длину фрагментов определяют с помощью электрофореза. Результаты исследования десяти гипотетических останков представлены на рис. 3.12. Они свидетельствуют о том, что останки принадлежат четырем мужчинам и шести женщинам.

Рис. 3.12. Установление половой принадлежности костных останков на основе определения длины фрагмента гена амелогенина

–  –  –

Для выявления генетического родства обычно используют локусы ДНК, находящиеся в 5 и более аллельных состояниях. С этой целью может быть использован локус (ТН01), имеющий 5 аллельных состояний, в которых динуклеотид ЦА повторяется от 6 до 10 раз: (ЦА)6, (ЦА)7, (ЦА)8, (ЦА)9, (ЦА)10. В составе генома каждого человека могут присутствовать из всех возможных только 1 или 2 аллельных локуса. Аллели легко различить по размерам ПЦР-фрагментов, определяемых с помощью электрофореза (рис. 3.13). Наличие двух полос на электрофореграмме указывает на гетерозиготное состояние локуса, одной – гомозиготного.

Сравнивая распределение фрагментов ДНК на электрофореграмме, можно сделать вывод о возможном родстве (или опровергнуть его) по вертикали (родитель – ребенок).

У ребенка размер одного фрагмента должен совпадать с размером одного из фрагментов матери, а размер другого – с одним из фрагментов отца. Если у индивидуумов отсутствуют одинаковые полосы, то они родственниками по вертикали не являются, а если таковые присутствуют, то родство по вертикали возможно. Об отсутствии родства по вертикали (если отсутствуют одинаковые аллели локуса) можно судить со 100 %-й вероятностью. О наличие же родства по вертикали (при наличии одинаковых аллелей локусов) можно говорить с определенной вероятностью.

Поэтому для установления родства по вертикали с высокой долей вероятности, как правило, анализируют картины распределения аллелей нескольких полиморфных локусов.

На рис. 3.13 представлен анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков.

Внимательно рассмотрев электрофореграмму, можно сделать вывод о том, что индивидуумы 3 и 7 по отдельности являются возможными родственниками по вертикали индивидуумам 4, 5 и 6. В то же время индивидуумы 3 и 7 между собой не являются родственниками по вертикали.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |



Похожие работы:

«Казанский федеральный университет Андреева Т.В., Кузнецов В.В. ЗООЛОГИЯ позвоночных Л.3 Казань 2011 Казанский федеральный университет Биолого-почвенный факультет Андреева Т.В., Кузнецов В.В. зоология позвоночных Учебное пособие к лабораторным занятиям по дисциплине ЗООЛОГИЯ ПОЗВОНОЧНЫХ Казань 2011 У Д К 596 (075.8) БКК 28.693.3я73 К 65 П ечат аем ся по реш ению кафедры ботаники и зоологии П ротокол № 1 от 1 сентября 2011 г. Рецензент: д.б.н., профессор М.Н.М укминов А ндреева Т.В., Кузнецов...»

«Министерство образования Республики Башкортостан Муниципальное образовательное учреждение дополнительного образования детей «Детский эколого-биологический центр» Демского района городского округа г. Уфы РБ Адрес: 450014 г.Уфа, Ул.Ухтомского дом 30 корпус 1, Тел/ факс (347) 281 -21-63 Объединение «Юный эколог»Методическая разработка открытого занятия на тему : Экология города и здоровье человека. Шумовое загрязнение» Составитель: педагог ДО высшей категории Юсупова Венера Мугимовна Уфа – 2011 г...»

«А.В. Ефимов Экологические аспекты обеспечения устойчивого развития сферы туризма В центре внимания современного развития общества стоят проблемы взаимодействия человека с окружающей средой и экологической устойчивостью планеты в целом. Сложившаяся экологическая ситуация вызывает обоснованную тревогу и опасения людей всего мира, в том числе и России. Постепенно все большее число людей включаются в борьбу за такие экологические ценности как чистый воздух, незагрязненную, богатую живыми...»

«ОТЗЫВ официального оппонента Юминовой Н.В. на диссертационную работу Малкина Геннадия Андреевича по теме: «Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток», представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.02 вирусология. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) не трансмиссивный зооноз, в России занимает ведущее место среди природноочаговых инфекций. Возбудители ГЛПС в составе рода Хантавирус принадлежат к обширному семейству...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, 3, с. 305-314 УДК 631.872:631.427.22:574.472 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.305rus СОСТАВ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПРИ РАЗЛОЖЕНИИ СОЛОМЫ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР В ДЕРНОВОПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЕ О.В. ОРЛОВА1, Е.Е. АНДРОНОВ1, Н.И. ВОРОБЬЕВ1, А.Ю., КОЛОДЯЖНЫЙ2, Ю.П. МОСКАЛЕВСКАЯ2, Н.В. ПАТЫКА2, О.В. СВИРИДОВА1 Трансформация микроорганизмами свежего органического вещества в пахотных почвах определяет такие процессы, как глобальный круговорот...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, 3, с. 369-376 УДК 631.559.2:631.847.21:579.64 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.369rus АГРОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫХ ФОРМ МИКРОБНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЗЕМЛЕДЕЛИЯ А.П. КОЖЕМЯКОВ1, Ю.В. ЛАКТИОНОВ1, Т.А. ПОПОВА1, А.Г. ОРЛОВА1, А.Л. КОКОРИНА2, О.Б. ВАЙШЛЯ3, Е.В. АГАФОНОВ4, С.А. ГУЖВИН4, А.А. ЧУРАКОВ5, М.Т. ЯКОВЛЕВА6 Выполнены комплексные исследования по созданию жидкой формы биопрепаратов для симбиотических и ассоциативных...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ЮГОРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УЧЕБНАЯ ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ПРАКТИКА (БОТАНИКА С ОСНОВАМИ ГЕОБОТАНИКИ) Методическое пособие для студентов дневного отделения факультета природопользования (специальность 013400) Ханты-Мансийск 2003 Составитель: Н.В.Кокорина. Рецензент: проф. Ю.М. Полищук Программа одобрена на заседании кафедры общей и теоретической экологии, протокол №_ от 2003 г. Заведующий кафедрой, проф._Ю.М. Полищук 1. ГЕРБАРИЗАЦИЯ И...»

«Российская академия наук Самарский научный центр Институт экологии Волжского бассейна А.Г. Бакиев, А.Л. Маленёв, О.В. Зайцева, И.В. Шуршина ЗМЕИ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ Тольятти УДК 598.12(470.43) Бакиев А.Г., Маленев А.Л., Зайцева О.В., Шуршина И.В. Змеи Самарской области. – Тольятти: ООО «Кассандра», 2009. – 170 с. В монографии обобщены литературные и оригинальные данные о змеях, населяющих Самарскую область. Приведены сведения об истории их изучения (глава 1). Данные о различных аспектах биологии...»

«БИОЛОГИЯ, 11 класс Ответы и критерии, Ноябрь 2010 ОТВЕТЫ на задания типа А и В Вариант/ Вариант № 1 Вариант № 2 Вариант № 3 Вариант № 4 задания А1 А2 А3 А4 А5 А6 А7 А8 А9 А10 А11 А12 А13 А14 А15 В1 ББААББА АББААБ БАААББ ББАБАА В2 АГВБДЕ БАВДГ БГАВД ДГЕВБА В3 Нормы оценивания При проверке работы за каждое из заданий А1 – А15 выставляется 1 балл, если ответ правильный, и 0 баллов, если ответ неправильный. За каждое из заданий В1, В2 выставляется 2 балла, если ответ правильный, 1 балл, если в...»

«СИСТЕМЫ ГЛУБОКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД СЕПТИКИ ЕМКОСТИ ИЗ ПЛАСТИКА ОГЛАВЛЕНИЕ О компании............................................................................3 Сертификаты «СБМ Групп»...............................................................4 Актуальность решения проблемы очистки сточных вод.........................»

«ГІДРО ЕКО ЛО ГІЯ M.O. Sbn Institute of Marine of Biology of NAS of Ukraine, Odesa SUPRALITTORAL HABITATS OF NORTH-WESTERN BLACK SEA Regional conditions of north-western Black Sea supralittoral habitats taken not enough into account in the international system of habitat classification EUNIS. Were distinguished specific Black Sea habitats of phytogenous coasts, accumulations of gravels, large limestone cobbles, stormy wracks, rocks, clay coasts etc., which need codification for it’s including to...»

«http://www.bio.bsu.by/molbiol/1.phtm Страница 1 Распечатать Сайт Биологического Факультета версия для печати или вернуться Ожог плодовых впервые зарегистрирован в Беларуси. Кафедра молекулярной биологии Биологического факультета БГУ. Ожог плодовых впервые зарегистрирован в Беларуси. 04-06-2008, 19:11 # molbiol ВНИМАНИЕ!!! В Беларуси впервые была обнаружена опасная инфекция растений бактериальный ожог плодовых. Впервые в Беларуси сотрудниками кафедры молекулярной биологии был выделен патогенный...»

«Сведения о результатах публичной защиты Овсянников Алексей Юрьевич Диссертация «Сезонная структурно-функциональная трансформация фотосинтетического аппарата хвои Picea pungens Engl, и P. obovata Ledeb. на территории Ботанического сада УрО РАН (г.Екатеринбург)» Специальность: 03.02.08 «Экология (в биологии)» Отрасль науки Биологические науки Члены диссертационного совета Д 002.211.02, присутствовавшие на заседании при защите диссертации: д.б.н. Ярмишко В. Т., д.б.н. Гамалей Ю. В., к.б.н. Юдина...»

«Биологически активная добавка к пище БЕТУЛИН — ИММУНО (Бетулафарм®) ИНСТРУКЦИЯ Изготовитель Область применения Рекомендуется в качестве биологически активной добавки ООО «Витамер», 129110, Москва, Орловок пище — источника бетулина и янтарной кислоты. Давыдовский пер., 1, пом. III. Состав Адрес производства: Владимирская обл., г. Петушки, Бетулин высокой степени очистки, экстракт эхинацеи ул. Совхозная, 11. пурпурной сухой, экстракт корня солодки сухой; состав По заказу ООО «БетулаФарм»,...»

«Вестник ДВО РАН. 2011. № 2 УДК 581.4+581.5+581.9 Д.Л.ВРИЩ Эколого-биологические особенности Rhododendron schlippenbachii Maxim. на северной границе ареала и перспективы использования его в озеленении Рассматриваются особенности произрастания Rhododendron schlippenbachii Maxim. на юге российского Дальнего Востока. Отмечено, что здешние экземпляры Rh. schlippenbachii отличаются от других по срокам цветения, окраске цветков и листьев, размерам и габитусу кустов. Описана собранная автором коллекция...»





 
2016 www.os.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Научные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.