WWW.OS.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Научные публикации
 

«КРИТЕРИИ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК ...»

На правах рукописи

ЕЛИСЕЕВА ДАРЬЯ ДМИТРИЕВНА

КРИТЕРИИ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ

РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Специальность: 14.01.11 – Нервные болезни

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Москва 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Завалишин Игорь Алексеевич;

доктор медицинских наук, профессор Быковская Светлана Нюневна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Бойко Алексей Николаевич;

доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис Владимирович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ



Защита диссертации состоится « » 2011 года в часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.006.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НЦН РАМН по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.

Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.006.01, кандидат медицинских наук Е.В. Гнедовская  2  

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Рассеянный склероз (РС) – распространенное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое поражает в основном лиц молодого возраста и почти неизбежно приводит на определенной стадии своего развития к инвалидизации [Compston A., Coles A., 2002].

В основе патогенеза РС лежит аутоиммунный процесс, который выражается в активации, дифференцировке и пролиферации Т-клеток, имеющих специфические рецепторы к компонентам миелина, т.е. в образовании аутореактивных Т-клеток, индуцирующих развитие демиелинизирующего процесса. Причем, ведущая роль в развитии иммунопатологического процесса при РС принадлежит популяции CD4+ Т-клеток. Считается, что CD4+ Т-лимфоциты первыми встречаются с антигеном и приобретают свойства эффекторных миелинспецифических клеток [Delgado S., Sheremata W.A., 2006; Hemmеr В. et al., 2002].

Активация Т-клеток происходит при взаимодействии соответствующего рецептора Т-лимфоцита и аутоантигена, связанного с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, который экспрессируется на антигенпрезентирующих (АПК) клетках, после чего происходит пролиферация и дифференцировка аутореактивных Т-клеток. В результате Т-лимфоциты приобретают аутоагрессивные свойства. На следующем этапе происходит проникновение активированных Т-лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в ЦНС и их взаимодействие с антигенами собственного миелина, в результате развивается воспалительный процесс, который приводит к повреждению миелина головного и спинного мозга.

По современным представлениям, развитие аутоиммунных заболеваний связано не только с дифференцировкой, пролиферацией и активацией эффекторных Т-клеток, но и с нарушением супрессорных механизмов, которые контролируют толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам [Mills K.H. et al., 2004].

Ключевую роль в механизмах иммуносупрессии играют регуляторные Тклетки с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ (Т рег). Т рег в норме составляют 3-5 % от  3   общего числа CD4+ T-клеток в периферической крови и лимфоидных тканях. Т рег созревают в тимусе и на 3-4 день неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоидные органы [Sakaguchi S. et al., 1995].

У больных аутоиммунными заболеваниями выявлено значительное снижение количества и нарушение функции Т рег. Так, дефект Т рег показан у больных системной красной волчанкой [Lyssik E.Y. et al., 2007], сахарным диабетом 1 типа [Dejaco C. et al., 2006], псориазом [Sugiyama H. et al., 2005], ревматоидным артритом [Pohlers D. et al., 2007].

Проведенные в настоящее время исследования показали, что имеется возможность увеличить количество Т рег, выделенных из крови пациента, культивированием их в условиях ex vivo [Selvaraj R.K., Geiger T.L., 2008; Allan S.E.

et al., 2008]. При этом, полученные культивированием Т рег высоко стабильны, долго живущие, обладают супреcсорными свойствами, неспецифичны и неиммуногенны и введение этих клеток пациенту с целью восстановления Т рег в крови больного до уровня нормы может стать инструментом коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях [Peters J.H. et al., 2008; Thornton A.M.

el., 2010].

Проведены пилотные испытания по введению аутологичных культивированных Т рег больным системной красной волчанкой [Lyssik E. Y. et al., 2007], диабетом 1-го типа [Godebu E., Summers-Torres D. et al., 2008], пациентам с реакции трансплантант-против хозяина после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [Корсунский И.А. и соавт., 2008; Riley J.L. et al., 2009]. При этом, получено достоверное увеличение количества Т рег в периферической крови этих больных, которое коррелировало с улучшением клинических показателей и не вызывало побочных реакций у больных.





В последнее время появились работы, посвящённые изучению роли Т рег в патогенезе рассеянного склероза [Haas J. et al., 2005, 2007; Venken K. et al., 2007, 2008, 2010; Feger U. С. et al., 2007].

Установлено, что Т рег играют определенную роль в нарушении регуляторных механизмов в аутоиммунитете, приводящих к развитию и прогрессированию РС. В то же время, результаты исследований количества и функциональной активности при РС отличаются значительной разноречивостью,  4   что обусловлено недостаточностью сопоставлений количества и функциональной активности Т рег с клинической картиной заболевания. Помимо этого, в настоящее время имеются лишь единичные описания результатов культивирования Т рег больных РС, а попыток использования Т рег в терапевтических целях при этом заболевании не проводилось.

В связи с вышеизложенным были сформулированы цели и задачи исследования.

Цели и задачи исследования Целью настоящего исследования является изучение роли регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в патогенезе рассеянного склероза.

Задачи исследования:

1. Исследовать состояние клеточного иммунитета больных ремитирующим РС путем изучения содержания основных субпопуляций лимфоцитов (фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD16+56+, CD19+) на различных этапах заболевания.

2. Изучить количество регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных РС в зависимости от стадии заболевания (обострение, ремиссия), длительности и тяжести его течения.

3. Изучить функциональную активность Т рег у больных РС в стадии обострения и ремиссии.

4. Провести культивирование аутологичных Т рег, выделенных из крови больных РС, с целью получения линий этих клеток (индукция Т рег ex vivo) и сравнить их фенотипические и функциональные характеристики с нативными Т рег.

5. Выполнить введение выращенных ex vivo регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ для коррекции иммунных нарушений у больных РС, от которых эти клетки были получены.

Научная новизна. Впервые исследовано количество и функциональная активность регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных РС в зависимости от стадии заболевания. При этом, установлены значимые корреляции стадии демиелинизирующего процесса с количеством Т рег. Проведено культивирование аутологичных Т рег путем их индукции ex vivo и доказана идентичность культивированных и нативных клеток. Впервые выполнено введение выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток с целью коррекции иммунных  5   нарушений у больных РС. Выявлено, что введение таких аутологичных клеток больным приводит к увеличению содержания Т рег в крови и хорошо переносится пациентами, и может в дальнейшем рассматриваться как новый подход к терапии этого заболевания.

Практическая и теоретическая значимость работы. На основании проведенного исследования расширены представления о взаимосвязи количественного и функционального дефекта регуляторных Т-клеток в механизмах формирования иммунопатологического процесса при РС, что имеет значение для понимания роли регуляторных механизмов в патогенезе этого заболевания. Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение в плане диагностического показателя наступающего обострения РС при снижении количества Т рег и формирования ремиссии заболевания при повышении числа этих клеток в крови больных. Выявлено, что регуляторные Т-клетки CD4+CD25+Foxp3+ можно выделить из периферической крови больного и вырастить в лабораторных условиях достаточное количество клеток, которое может компенсировать их дефицит в организме и соответственно применяться для коррекции иммунных нарушений при РС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммунофенотипическое исследование крови больных РС выявило дисбаланс CD4+ и CD8+ Т-клеток за счет повышения количества СD8+ Т-клеток.

2. Выявлено снижение количества Т рег в крови больных РС в целом по группе.

Установлено, что в стадии обострения РС количество Т рег значительно снижено, а переход в стадию ремиссии заболевания характеризуется ростом их числа.

3. Отмечено снижение функциональной активности Т рег, выделенных из периферической крови больных РС, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.

4. Установлена обратная зависимость между количеством Т рег и степенью инвалидизации и длительностью РС, что является отражением степени активности иммунопатологического процесса.

5. В результате культивирования аутологичных Т рег больных количество этих клеток увеличивается в десятки раз. При этом, культивированные Т рег по  6   фенотипическим и функциональным характеристикам идентичны нативным.

Введение выращенных ex vivo аутологичных Т рег больным РС позволяет повысить уровень Т рег в крови больных и не вызывает побочных эффектов.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, II, III, V, VI неврологических, нейрореанимационного и научно-консультативного отделений, отделения лучевой диагностики, лабораторий нейрохимии, гемореологии и гемостаза, эпидемиологии и профилактики заболеваний нервной системы, клинической нейрофизиологии и патоморфологии Научного центра неврологии РАМН 06 апреля 2011 г.

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на: заседании XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз»

(Санкт-Петербург, 2009 г.), IX Международном конгрессе «Новые направления иммуносупрессии и иммунотерапии” (Женева, 2010 г.), Совете молодых ученых НЦН РАМН (Москва, 2011 г.), V Сибирской межрегиональной научнопрактической конференции «Рассеянный склероз: 30 лет спустя» (Новосибирск 2011 г.), V Международной конференции по иммунологической регуляции (Давос, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики пациентов и методов исследования, главы, посвященной результатам, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 199 источников, из них 11 отечественных и 188 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика больных В настоящей работе представлены результаты клинико-иммунологического исследования, в том числе, определение количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ (Т рег), у 50 больных с достоверным диагнозом РС. 19 пациентов из этой группы изучены в динамике, как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии. 10 больным РС проведено исследование функциональной  7   активности Т рег в смешанной культуре лимфоцитов. Выращено 5 клеточных линий CD4+ Т-клеток 5 больных РС и 3 здоровых доноров для индукции ex vivo CD4+CD25+Foxp3+.

(культивирования) регуляторных Т-клеток Проведено подкожное введение выращенных ex vivo (культивированных) Т рег 5 больным РС.

Клиническое обследование больных проводилось в 6-ом неврологическом отделении НЦН РАМН, руководитель отделения – профессор И.А. Завалишин.

У больных была детально изучена клиническая картина заболевания с использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса, проведена магнитно-резонансная томография (МРТ) головного и/или спинного мозга. Все 50 пациентов, включенных в исследование, имели достоверный диагноз ремитирующего РС, согласно диагностическим критериям Poser С.М. (1998г) и McDonald W.I. (2005г.). Группа пациентов состояла из больных РС: в стадии ремиссии – 31 человек, в стадии обострения – 19 человек. Среди обследованных лиц преобладали женщины в соотношении 1:2,3. Возраст больных варьировал от 19 до 56 лет. Тяжесть неврологического дефицита оценивалась с использованием расширенной шкалы инвалидизации EDSS (The Expanded Disability Status Scale), которая у больных в стадии обострения РС находилась в пределах от 1,0 до 5,0, в стадии ремиссии РС от 1,0 до 2,5 баллов. У 19 больных в стадии обострения болезни, были взяты образцы крови в динамике, т.е. как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания. Этим больным, до забора крови для определения иммунофенотипического состава крови, проведены неврологический осмотр, при котором выявлено нарастание или появление новой неврологической симптоматики и МРТ головного и/или спинного мозга, позволяющая выявить активные очаги демиелинизации. После выявления обострения процесса больным проводилась пульс-терапия метилпреднизолоном (суммарная доза 3000 - 5000 мг).

Повторное взятие крови осуществлялось спустя не менее 4-х недель после окончания гормональной терапии. У пациентов, изученных в динамике в стадии обострения и в стадии ремиссии, средний возраст составил 34,9±9,76 лет (25-56), балл по шкале EDSS находился в пределах от 1,5 - 5,0, в стадии ремиссии степень выраженности неврологического дефицита у этих больных составила 1,55±0,57 [1,0;3,0] баллов.

 8   У всех 50 больных была проведена оценка периода от момента постановки диагноза РС до начала исследования. В целом по группе длительность РС варьировала от 3 до 207 месяцев. Выделено 2 группы больных по длительности течения РС. Первую группу составили 28 больных, страдающих РС менее 36 месяцев, вторую – 22 больных, страдающих РС более 36 месяцев. При этом, средняя длительность заболевания в первой и второй группах была равна 15,29 ±11,12 (3-35) и 110,5±51,17 (44-208) месяцев, соответственно.

В качестве контрольной группы исследован иммунофенотип крови 21 здорового донора, соответствующих больным по возрастному и половому составу.

Среди здоровых лиц, преобладали женщины 1:1,63. Возраст доноров находился в пределах от 19 до 57 лет.

Определение функциональной активности Т рег проведено 10 больным РС, из них 7 пациентам в стадии обострения и 3 – в стадии ремиссии. Среди них 7 женщин и 3 мужчин. Возраст этих больных РС варьировал от 24 до 39 лет.

Группа больных РС, у которых были взяты образцы крови для культивирования аутологичных Т рег и последующего их подкожного введения состояла из 5 человек. Данная группа больных состояла из 4 женщин и 1 мужчины, возраст пациентов составил от 26 до 37 лет, средний балл по шкале EDSS был равен 2,9 [2,5±3,0].

Протоколы диссертационного исследования «Критерии активности патологического процесса при рассеянном склерозе по результатам исследования регуляторных Т-клеток» и клинического исследования «Иммунокоррегирующая терапия ремитирующего рассеянного склероза путем введения выращенных ex vivo CD4+CD25+Foxр3+»

аутологичных регуляторных Т-клеток были одобрены Локальным Этическим Комитетом НЦН РАМН. Протокол №9/08 от 25 июня 2008 года. Все пациенты дали согласие на участие в исследовании, подписав информированное согласие.

Методы исследований Исследование иммунофенотипического состава крови, в том числе определение количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ больных РС и здоровых доноров, проводилось с использованием метода проточной цитометрии  9   на базе лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии НЦН РАМН, руководитель – профессор А.А. Болдырев.

Все измерения проводились на проточном цитометре FACS Calibur(tm) (BD Biosciences). Для оценки количества клеток CD3+, CD8+, CD4+, CD4+CD25+, CD19+, CD16+CD56+ в мононуклеарной фракции, клеточную суспензию окрашивали соотвествующими антителами. Оценка экспрессии поверхностных маркеров проводилась в соответствии с протоколом, разработанным производителем набора антител BD Multitest IMK Kit(tm) (BD Biosciences, США). Процентное содержание позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывалось при помощи программного обеспечения MACSQuantify(tm) (Miltenyi Biotec GmbH, Германия).

Выделение регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxр3+ из периферической крови больных рассеянным склерозом осуществлялось инкубацией CD4+CD25+ Т-клеток с PE-мечеными анти-человеческими антителами к FoxP3, клон PCH101 (eBioscience, США).

Определение функциональной активности и культивирование регуляторных Тклеток CD4+CD25+Foxp3+ проводилось на базе Отдела клеточных технологий и регенеративной медицины ГОУ ВПО РГМУ, руководитель отдела – профессор С.Н. Быковская.

Данный метод включал забор 40 мл периферической крови у испытуемого, выделение субпопуляций регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов и АПК донора, окраску эффекторных Т-лимфоцитов витальным красителем карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (Carboxyfluorescein succinimidyl ester – CFSE) и пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов (mixed lymphocyte reaction – MLR), которая оценивается по редукции внутриклеточного красителя CFSE методом проточной цитометрии.

Для культивирования Т рег применяли среду RPMI-1640, содержащую феноловый красный, L-глутамин и 25мМ HEPES (Gibco, Великобритания) c добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллинстрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли интерлейкин (ИЛ) - 2 (ИЛ-2, R&D Systems, Великобритания), мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, РФ) и мышиные моноклональные антитела к человеческому рецептору CD28 (BD   10   Pharmingen, США). Клетки культивировали во флаконах 25 см2 или 75 см2 в CO2инкубаторе при 370С в атмосфере 5% СО2. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 дня. Время культивирования составляло от 5-8 дней. Далее оценивались фенотипические характеристики (экспрессии маркеров) и экспансия (увеличение количества) Т рег после культивирования с помощью проточной цитометрии, и изучалась супрессорная активность нативных и индуцированных ex vivo Т рег.

На 7-12й день культивирования клетки концентрировали, подсчитывали количество живых клеток в гемоцитометре и отмывали центрифугированием в 50 мл конических стерильных пробирках в фосфатном солевом буферном растворе без Са2+ и Mg2+ в течение 10 мин при 300 g. Осадок разводили в 2-3 мл стерильного физиологического раствора или 6% раствора полиглюкина и сразу набирали в стерильный одноразовый шприц, который помещали в стерильную упаковку и в специальный контейнер для переноса клеток, который незамедлительно транспортировался в НЦН РАМН.

После доставки в 6-ое неврологическое отделение НЦН РАМН, клетки немедленно вводили пациенту подкожно, в область передней брюшной стенки.

После введения клеток пациент находился на стационарном лечении в 6-ом неврологическом отделении НЦН РАМН в течение 2-х недель. В течение последующего года наблюдение за пациентами осуществлялось в амбулаторном порядке, с явкой на осмотр 1 раз в 3 месяца.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США) для персонального компьютера. Для нормально распределенных признаков вычислялось среднее значение и стандартное отклонение, результаты представлены в виде m±. При выполнении описательной статистики для количественных признаков, распределение которых не подчинялось законам нормального распределения, вычислялись медиана и интерквартильный размах – нижний 25% и верхний 75%-ный интервалы. Результаты представлены в виде медианы (нижний квартиль (LQ)=; верхний квартиль (UQ)=). Сравнение двух независимых групп по одному признаку для количественных, качественных, порядковых и номинальных признаков проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Взаимосвязь двух

–  –  –

Таким образом, по нашим данным, в крови больных РС выявлено достоверное снижение количества Т рег независимо от стадии заболевания.

Однако, обращает на себя внимание, что в большей степени содержание Т рег снижено при обострении аутоиммунного процесса. Аналогичные данные получены в работах других авторов [Haas J. et al., 2007; Venken K. et al., 2007, 2008, 2010;

Jean M. Fletcher et al., 2009]. Причиной данного обстоятельства может быть увеличенная продукция провоспалительных цитокинов активированными CD4+ Тклетками, которые угнетают как образование Т рег на периферии, так и повреждают уже существующие клетки. Помимо этого, может наблюдаться цитотоксическое действие CD8+ Т-клеток. Venken K. с соавт. (2008) связывают наличие малого числа Т рег в крови больных РС со снижением уровня экспрессии гена Foxp3 на периферических Т рег, в результате чего нарушается образование этих клеток, а Т рег, циркулирующие в крови, подвергаются повреждающему действию эффекторных клеток.



При динамическом анализе периферической крови 19 больных в стадии обострения и в стадии ремиссии РС получено достоверное повышение количества   14   Т рег с 0,88±0,45% [0,19;1,90] до 2,57±1,52% [0,63;5,50] (р=0,00003), которое не достигало уровня здоровых лиц (3,56 ± 1,53% [1,86;6,07]) (р=0,04).

Таким образом, установлено, что при переходе заболевания в фазу ремиссии отмечается увеличение числа Т рег в крови больных РС. Такие результаты получены впервые, т.к. ранее не проводилось подобных исследований у одних и тех же больных РС в динамике. Следует отметить, что некоторыми исследователями продемонстрирован дефицит Т рег в крови больных в стадии обострения [Viglietta V. et al., 2004; Venken K. et al., 2007, 2008], причем, основной причиной низкого количества Т рег в обострении РС, по их мнению, является миграция этих клеток с периферии в участки демиелинизации, что объясняется выявлением количественного преобладания Т рег в ЦСЖ больных, особенно в период обострения процесса [Venken K. et al., 2008; Feger U. et al., 2007; Haas J et al., 2005]. Увеличение количества Т рег в крови больных РС в стадии ремиссии заболевания может быть связано с тем, что в дополнение к натуральным Т рег, образующимся в тимусе, прибавляются индуцированные на периферии Т рег. Эти клетки образуются из CD4+ Т-клеток, примированных антигеном. Необходимым условием для появления индуцированных Т рег является присутствие трансформирующего фактора роста (Transforming growth factor beta – TGF). При этом индуцированные Т рег обладают таким же фенотипом и функциями как и натуральные.

В процессе сопоставления выраженности неврологического дефицита, который в группе больных РС в целом составил 2,84±1,26 [1,0-5,5] баллов со средним содержанием Т рег (1,38±0,86% [0,19;4,40]) в периферической крови этих пациентов, выявляется обратная корреляция (r=-0,7175), т.е., чем больше выражена интенсивность неврологических симптомов, которая является отражением активности иммунопатологического процесса, тем меньшее количество Т рег определяется в крови больных (рис. 2).

–  –  –

2,5 + 2,0 1,5 1,0 0,5

–  –  –

3,0 + 2,5 + 2,0 1,5 1,0 0,5

–  –  –

Рис. 3. Обратная корреляция между количеством регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в периферической крови больных и длительностью РС Для уточнения этого результата, мы разделили больных РС на 2 группы: у лиц, болеющих меньше 36 (15,11±11,20 [3;35]) месяцев количество Т рег составило 1,94±0,75% [0,6;4,4], в то время как в группе пациентов, болеющих более 36 (106,83±51,73 [44;207]) месяцев – 0,72±0,37% [0,19;1,8]. Получена статистически достоверная разница в содержании Т рег между этими группами больных (р=0,0001).

  17   Таким образом, установлено, что содержание Т рег в крови больных РС обратно пропорционально длительности заболевания, что, вероятно, связано с истощением регуляторных механизмов при длительно существующем аутоиммунном процессе. Эти данные подчеркивают влияние повторяющихся эпизодов активации аутореактивных клеток на иммунорегуляторное звено иммунитета.

Помимо уменьшения количества Т рег в крови, также важную роль в развитии иммунопатологического процесса при РС играют нарушения функциональной (супрессорной) активность этих клеток, т.е. способность Т рег подавлять пролиферацию эффекторных CD4+ Т-клеток.

Нами исследована супрессорная активность Т рег, выделенныех из периферической крови 7 больных РС в стадии обострения, 3 больных – в стадии ремиссии и 5 здоровых доноров.

Установлено, достоверное снижение функциональной активности Т рег у больных РС как в стадии обострения (55,94±7,76% [48,90;69,60]) (р=0,004), так и в стадии ремиссии (65,20±4,92% [59,70;69,20]) (р=0,02) по сравнению с группой здоровых доноров (86,92±4,41% [79,7;91,2]). Статистически значимого отличия супрессорной активности Т рег на разных стадиях аутоиммунного процесса при РС не получено (р=0,14).

Для определения супрессорного влияния Т рег на эффекторные клетки рассчитывают индекс пролиферации (ИП), который представляет собой способность CD4+ Т-клеток пролиферировать в отсутствии и в присутствии Т рег.

Так, при определении ИП CD4+ Т-клеток в отсутствии Т рег, статистически достоверные отличия наблюдались между группой доноров и больными РС как в стадии обострения (р=0,004), так и больными в стадии ремиссии (р=0,025). При сравнении значения ИП CD4+ Т-клеток на разных стадиях заболевания отмечалось статистически значимое его повышение у больных РС в стадии обострения (р=0,03).

При инкубации СD4+ Т-клеток с Т рег получены достоверные различия между группой доноров и группой больных как в стадии обострения (р=0,004), так и в стадии ремиссии (р=0,025) (табл. 3).

–  –  –

С целью изучения супрессорной активности Т рег после экспансии, мы сравнили способность культивированных и нативных Т рег ингибировать пролиферацию клеток-мишений (CD4+) в смешанной культуре лимфоцитов.

Установлено, что у больных РС супрессорная активность нативных (53,04±4,03% [48,2;56,8]) и культивированных Т рег (55,04±4,66% [50,20;60,10]) достоверно не отличалась (р=0,94).

Таким образом, установлено, что выращенные ex vivo регуляторные ТCD4+CD25+Foxр3+ клетки по фенотипическим и функциональным характеристикам полностью идентичны нативным Т рег, выделенным из периферической крови больного, и их количество после экспансии возрастает в десятки раз На основании, полученных нами результатов, мы предположили, что введение аутологичных (собственных) регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ больным РС с целью восстановления количества этих клеток до уровня нормы может использоваться в качестве коррекции иммунных нарушений при этом заболевании.

  20   Нами однократно проведено введение культивированных аутологичных регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ пяти больным РС.

После введения выращенных ex vivo аутологичных регуляторных Т-клеток CD4+CD25+Foxр3+ у всех больных РС через 2 недели выявлено увеличение содержание этих клеток в периферической крови в среднем с 0,6±0,14% [0,4;0,8] до 1,4±0,44% [1,1;1,9], (p=0,009) (табл. 5).

Таблица 5 Увеличение количества Т рег в периферической крови больных РС через 2 недели после введения выращенных ex vivo Т рег

–  –  –

Таким образом, в результате пилотного исследования получено достоверное увеличение содержания Т рег в крови больных РС после подкожного введения культивированных аутологичных Т рег, что свидетельствует о возможности миграции этих клеток в кровь. Причем, у пациентов не наблюдалось никаких побочных реакций в ответ на инъекцию выращенных ex vivo Т рег, как в первые дни, так и в течение последующих 12 месяцев наблюдения, что указывает на безопасность и потенциальную возможность применения культивированных аутологичных Т рег в клинике для коррекции иммунных нарушений у больных РС.

Выводы:

1. Исследование иммунофенотипического состава крови больных РС выявило разнонаправленные изменения содержания CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, что является отражением активности аутоиммунного процесса при этом заболевании.

2. Установлено снижение количества регуляторных Т-клеток с фенотипическими характеристиками CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных РС в целом по группе.

  21  

3. Выявлено, что больший количественный дефект Т рег имеет место у больных в стадии обострения РС, а при переходе в стадию ремиссии число Т рег возрастает.

4. Получено снижение супрессорной активности Т рег больных РС как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.

5. Установлена обратная зависимость между количеством Т рег в периферической крови больных и длительностью РС, а также между количеством Т рег и тяжестью течения РС, что отражает степень активности аутоиммунного процесса.

6. Показано увеличение количества Т рег в 30-90 раз с помощью их индукции ex vivo. Причем, культивированные Т рег имеют фенотипические и функциональные характеристики нативных Т рег.

7. В результате введения выращенных ex vivo аутологичных Т рег больным РС наблюдается повышение уровня Т рег в крови пациентов, при этом в течение 12месячного периода наблюдения за больными после инъекции Т рег не зарегистрировано побочных эффектов.

Практические рекомендации:

1. Снижение количества Т рег можно использовать как диагностический критерий активности наступающего обострения, а повышение их количества рассматривать как прогностический тест формирования ремиссии Т рег клетки CD4+CD25+Foxp3+ можно выделить из периферической крови 2.

больного и вырастить в лабораторных условиях такое количество клеток, которое потенциально может компенсировать их дефицит в организме и, соответственно, использоваться с терапевтической целью

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишин И.А. Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+FoxP3+ при рассеянном склерозе // Нейроиммунология. – 2009. – Т. 7. – № 1. – С. 35 – 36.

2. Завалишин И.А., Елисеева Д.Д. Патогенетическая терапия рассеянного склероза // Лечащий врач. – 2009. – №9. – С. 43 – 46.

  22  

3. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишин И.А. Роль регуляторных Тклеток в патогенезе рассеянного склероза // Журн Медицина критических состояний. – 2010. – № 5. – С. 18 – 23.

4. Елисеева Д.Д., Завалишин И.А., Быковская С.Н., Федорова Т.Н., Карандашов Е.Н., Трунова О.А. Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+Foxр3+ у больных ремитирующим рассеянным склерозом // Анналы клин. и эксперим. неврологии. – 2011. – Т. 5. – № 2. С. 9 – 13.

5. Завалишин И.А., Переседова А.В., Стойда Н.И., Алексеева Н.С., Гулевская Т.С., Гурьянова О.Е., Арзуманян Н.Ш., Елисеева Д.Д., Трифонова О.В., Брюхов В.В. Вопросы диагностики и лечения рассеянного склероза // Журн неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. – 2011. – Т. 111. – № 6. – С. 88 – 95.

6. Завалишин И.А., Елисеева Д.Д. Лечение рассеянного склероза // Доктор.Ру. – 2009. – № 4. – С. 25 – 29.

7. D. Eliseeva, I. Zavalishin, E. Lyssuk, E. Karandashev, S. Bykovskaia. Pathological impairments of regulatory T cells CD4+CD25+Foxp3 in multiple sclerosis and injections of expanded ex vivo autologous T regs // Materials of 9th International Conference on New Trends in Immunosuppression and Immunotherapy, Geneva, Switzerland. – 2010. – P. 37.

8. Елисеева Д.Д., Быковская С.Н., Завалишин И.А. Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+Foxp3+ при ремитирующем рассеянном склерозе // Материалы V Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз: 30 лет спустя». Новосибирск. – 2011. – С. 53-58.

9. Eliseeva D., Lyssuk Е., Karandashov E., Zavalishin I., Bykovskaia S., Karaulov A.

Expanded ex vivo regulatory T cells CD4+CD25+FOXP3+ (Tregs) can restore immune regulation in patients with remitting-relapsing multiple sclerosis (RR-MS) // Final Programme and Abstracts. V World Immune Regulation Meeting. Davos, Switzerland.

– 2011. P.67.

  23  

Условные сокращения:

АПК - антиген-презентирующие клетки ИЛ - интерлейкин ИП - индекс пролиферации ИРИ - иммунологический регуляторный индекс МНК - мононуклеарные клетки МРТ - магнитно-резонансная томография РС - рассеянный склероз Т рег - регуляторные Т- клетки CD4+CD25+Foxp3+ ЦНС - центральная нервная система ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты CFSE - сarboxyfluorescein succinimidyl ester (карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир) EDSS - the Expanded Disability Status Scale (расширенная шкала инвалидизации) MLR - mixed lymphocyte reaction (смешанная культура лимфоцитов) TGF - transforming growth factor beta (трансформирующий фактора роста)   24  



Похожие работы:

«Оглавление ПРЕЗИДЕНТ Путин одобрил создание в РФ фонда по развитию отечественного ПО Путин поручил проработать вопрос субсидирования железнодорожных перевозок дальневосточной рыбы в европейскую часть РФ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ДУМА ФС РФ В Госдуме раскритиковали запрет Рособрнадзора 11 вузам принимать абитуриентов Госпредприятия будут обязаны применять профстандарты законопроект прошел 1 чтение В Госдуме дали оценку Маршу мира Госдума расширяет список тех, кто должен раскрывать свои доходы и расходы...»

«© Коллектив авторов., 2009 УДК 616.89+616.89-008.441.13 КРАТКИЙ ОБЗОР ПРОБЛЕМЫ «ДВОЙНОГО ДИАГНОЗА» (СОЧЕТАНИЕ ПСИХИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ И РАССТРОЙСТВ ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПСИХОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ) Е.А.Шитов, Д.Н.Киселев, Д.И.Шустов Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Проблема коморбидности психических заболеваний и зависимости от алкоголя, наркотиков и других психоактивных веществ приобретает в настоящее время особую актуальность в связи с масштабами этой...»

«Химия растительного сырья. 2000. № 3. C. 5–12. УДК 615.322: 633.81 (571.1) ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ ЭФИРНО-МАСЛИЧНЫХ РАСТЕНИЙ ФЛОРЫ СИБИРИ Г.И. Калинкина,* Т.П. Березовская, С.Е. Дмитрук, Е.Н. Сальникова Сибирский медицинский университет, Московский тракт, 2, Томск, 634050 (Россия) Представлены историческая справка и обзор наиболее значимых публикаций по химическим и фармакологическим исследованиям эфирно-масличных растений флоры Сибири, проведенным томскими учеными,...»

«Ты победишь болезнь свою Библиотека проекта «ПРЕОБРАЖЕНИЕ» А.М.Степанов «Основы медицинской гомеостатики» А.М.Степанов ОСНОВЫ МЕДИЦИНСКОЙ ГОМЕОСТАТИКИ (Лекции по теории и практике биоинформационных коррекций) Москва 1993 УДК 519.7 ОСНОВЫ МЕДИЦИНСКОЙ ГОМЕОСТАТИКИ.(Лекции по теории и практике биоинформационных коррекций)./Степанов А.М. Москва: -1993.-222 с. -библиогр.: 169. Ил. 37. Монография посвящена системным методам анализа переноса и реализации информации в биологии и медицине. Излагаются...»

«Медицинская экология Юг России: экология, развитие. №3, 2009 Medical ecology The South of Russia: ecology, development. №3, 2009 МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ УДК 616+613.1 ЭКОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ НАСЕЛЕНИЯ ГОРОДА МАХАЧКАЛЫ РЕСПУБЛИКИ ДАГЕСТАН © 2009. Рябова А.В., Гасангаджиева А.Г., Гаджиева З.Я. Дагестанский государственный университет, кафедра экологии Исследование выполнено на средства гранта Президента РФ для поддержки молодых...»

«ГБУЗ ВО «Медицинский информационно-аналитический центр» Рекомендации по ведению электронной медицинской карты с использованием сервиса «РФ ЕГИСЗ» Сентябрь 2013 год Оглавление Введение. 1. Ведение истории болезни в электронном виде в условиях стационара. 5 1.1 Регистрация пациента 1.2 Направление на госпитализацию 1.3 Оформление случая госпитализации 1.4 Движение по отделениям 1.5 Оформление пациента на койку 1.6 Оформление протоколов осмотра 1.7 Услуги 1.8 Назначение 1.9 Закрытие случая 2....»

«От теории к практике Плацентарный препарат CURACEN в мезотерапии стареющей кожи Старение затрагивает практически все морфофункциональные структуры кожи, поэтому борьба с возрастными изменениями должна подразумевать использование средств и методов, влияющих на разные доктор медицинских наук, профессор кафедры кожных и венерических болезней патогенетические звенья инволюционных процессов. МГМСУ, Повышение интенсивности регенераторных процессов — одна из основных задач в решении проблем старения...»

«1 2.2. Ведение медицинской документации 2.2. Ведение медицинской документации Обеспечение функционирования четкой и отлаженной Документосистемы документооборота — одно из основных слаоборот гаемых эффективной деятельности любой организации здравоохранения. Качество ведения Наиболее актуальной проблемой при этом является камедицинской чество ведения медицинской документации. документации Определение термина «медицинский документ» дано Медицинский в Приказе Минздрава России от 22.12.2001 г. № 12...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет ПСИХОЛОГИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ Екатеринбург УДК 159.9(08) ББК 88.8 Психология профессиональной культуры: коллективная монография / Под науч. ред. Е. В. Дьяченко / Екатеринбург: УГМУ, 2014. – 221 с. ISBN 978-5-89895-689-9 В монографии представлены результаты теоретических, эмпирических и прикладных исследований психологических оснований профессиональной культуры в...»

«СВЕДЕНИЯ О РЕЗУЛЬТАТАХ ПУБЛИЧНОЙ ЗАЩИТЫ СОИСКАТЕЛЯ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК ТАРАСОЧКИНА ДАРИЯ СЕРГЕЕВНА Тема диссертации: «ГИПЕРФРАКТАЛКИНЕМИЯ И КАРДИОГЕМОДИНАМИЧЕСКОЕ РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ МИОКАРДА ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ И СТЕНОКАРДИИ НАПРЯЖЕНИЯ» по специальности 14.01.04. «Внутренние болезни» медицинские науки Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Министерства...»

«ДЕПАРТАМЕНТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ИВАНОВСКОЙ ОБЛАСТИ ПРИКАЗ № 149 31.07.2015 О совершенствовании организации медицинской помощи пострадавшим при дорожно-транспортных происшествиях на территории Ивановской области В целях совершенствования организации медицинской помощи пострадавшим при дорожно-транспортных происшествиях (далее – ДТП), реализации мероприятий по снижению смертности населения Ивановской области от транспортных несчастных случаев, упорядочения мониторинга основных целевых показателей...»

«ЭТИЧЕСКИЙ КОДЕКС ВРАЧА ГАУЗ «Республиканский клинический кожно-венерологический диспансер» МЗ РТ Казань, 2014г. Принимая во внимание важнейшую роль в современном обществе одной из самых гуманных профессий — врача, учитывая традиционно большое значение этического начала в медицине и здравоохранении, руководствуясь документами по медицинской этике, которые содержатся в международных документах, а также нормативных документах Российской Федерации, Ассоциация медицинских работников Республики...»

«Б.Г. Валентинов, А.А. Хадарцев, В.Г. Зилов, Э.М. Наумова, И.Г. Островская, С.Н. Гонтарев, Ли Чуюань БОЛЮСЫ ХУАТО (результаты и перспективы применения) Тула–Белгород, 2012 Б.Г. Валентинов, А.А. Хадарцев, В.Г. Зилов, Э.М. Наумова, И.Г. Островская, С.Н. Гонтарев, Ли Чуюань БОЛЮСЫ ХУАТО (результаты и перспективы применения) Монография под редакцией Б.Г. Валентинова, А.А. Хадарцева Тула–Белгород, 2012 УДК 615.038 Болюсы Хуато (результаты и перспективы применения): Монография / Под ред. Б.Г....»

«Дайджест Рынка медицинских изделий Июль 2015 www.md-pro.ru © MDpro Оглавление Ключевые события в мире Ключевые события в России Основные показатели рынка в июне 2015 года www.md-pro.ru © MD-pro Ключевые события в мире M&A Hill-Rom покупает Welch Allyn за $2,05 млрд Американская компания Hill-Rom, мировой лидер по производству реанимационных и госпитальных кроватей, объявила о приобретении американской компании Welch Allyn, работающей на рынке диагностического оборудования. Сумма сделки – $2,05...»

«Министерство здравоохранения Республики Тыва Государственное образовательное бюджетное учреждение среднего профессионального образования Республики Тыва «РЕСПУБЛИКАНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ» Требования к написанию и оформлению курсовой работы Государственное образовательное бюджетное учреждение среднего профессионального образования Республики Тыва «РЕСПУБЛИКАНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ» НАЗВАНИЕ ТЕМЫ КУРСОВАЯ РАБОТА Специальность.. ПМ.. МДК.. Работу выполнил (а).. (фамилия)... (имя)......»





Загрузка...


 
2016 www.os.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Научные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.