WWW.OS.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Научные публикации
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 12 |

«ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЙ ПРОГНОЗ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ОНКОЛОГИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ИМЕНИ Н.Н.БЛОХИНА»

На правах рукописи

ГРИВЦОВА ЛЮДМИЛА ЮРЬЕВНА

ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЙ ПРОГНОЗ

ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В

ОНКОЛОГИИ

14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант:

профессор, доктор медицинских наук, Н. Н. Тупицын МОСКВА 2015 Содержание Введение ………………………………………………………………...стр. 4 Глава 1. Литературный обзор Стволовые кроветворные клетки...…………………………………...стр. 19 Глава 2. Материалы и методы………………………………………...стр. 75 Глава 3. Модификация метода оценки количества стволовых кроветворных клеток………………………....……………………….стр. 90 Глава 4. Результаты

4.1 Общая иммуно-гематологическая характеристика кроветворной ткани аутологичной и аллогенной трансплантации……………….……………………………..стр. 97



4.2 Иммунологический профиль мобилизованных периферических СКК онкологических больных и доноров…………………………………………................стр. 104

4.3 Линейно-нерестриктированные антигены мобилизованых СКК..............……….……………………..стр. 117

4.4 Линейно-рестриктированные антигены мобилизованных СКК………………………………………стр. 155

4.5 Субпопуляции мобилизованных СКК взрослых больных и эффективность аутологичной трансплантации кроветворной ткани……..………………стр. 185

4.6 Аутологичная трансплантация мобилизованных СКК у детей, больных злокачественными опухолями…………………………………………………..стр. 201

4.7 Субпопуляции мобилизованных СКК доноров и эффективность аллогенной трансплантации в детской онкологии……

Глава 5. Заключение…….

.………………………………………….стр. 233 Выводы ……………………………………………

Практические рекомендации………………………………………стр. 266 Список сокращений………………………………………………...стр. 267 Приложение №1. Рисунки к главе 4..……………………………...стр. 270 Список цитируемой литературы..…………………………………стр. 304 Введение Актуальность исследования Стволовые клетки-предшественницы гемопоэза или стволовые клетки крови (СКК) дают начало всем росткам гемопоэза (эритроидным, гранулоцитарным, мегакариоцитарным, лимфоидным, моноцитарным) и поддерживают гемопоэз в стабильном состоянии на протяжении всей жизни человека. Характерными чертами этих клеток являются способность к самоподдержанию, пролиферации и дифференцировке (Чертков И.Л. и соавт.,1998; Kondo M., 1997).

Начиная с последнего триместра внутриутробного развития, на протяжении всей жизни человека основным гемопоэтическим органом является костный мозг – именно там сосредоточено абсолютное большинство СКК. Содержание столовых клеток в костном мозге у здоровых индивидуумов колеблется в пределах 0,5 - 4,0% среди мононуклеаров (AnHLA-DRews R.G. et al., 1986; Civin C.I. et al., 1984).

Концентрация стволовых клеток в периферической крови в состоянии стабильного кроветворения мала - менее 0,01%, что делает затруднительным их изучение даже самыми чувствительными методами.

Открытие феномена мобилизации СКК сделало возможным использование стволовых клеток крови для восстановления кроветворения после введения высоких доз цитостатиков и открыло новую эру в лечении когорты пациентов, требующих значительной эскалации доз химиопрепаратов (Heguet O., 2015).

Феномен мобилизации стволовых кроветворных клеток заключается в их способности покидать костный мозг и выходить в кровеносное русло под влиянием повреждающих воздействий (например, цитостатиков), цитокинов, ростовых или колониестимулирующих факторов (Link D.C., et al., 2000).

При мобилизации стволовые клетки крови сохраняют свои главные свойства – значительный пролиферативный потенциал и способность к дифференцировке в зрелые клетки крови. (Chtinantakul K. et al., 2012; Eaves C.J., et al., 2015; Mohle R. еt al., 1999; Zanjani B.D. et al., 1999).

В процессе мобилизации концентрация СКК возрастает до уровней, достаточных для трансплантации. Детальное изучение мембранных маркеров этих клеток проводится иммунологическими методами, в частности, проточной цитометрией, с использованием многопараметровой иммунофлуоресценции и идентификации СКК на основании экспрессии антигена CD34.

До настоящего времени большинство трансплантаций кроветворной ткани - это аутологичные трансплантации мобилизованных периферических СКК, когда больному после введения сверхвысоких доз химиопрепаратов кроветворение восстанавливают его собственными стволовыми кроветворными клетками, заготовленными заранее в период ремиссии основного заболевания (Korbling M., et al., 2011).

При аутологичной трансплантации у онкологического больного всегда существует риск ретрансплантации болезни, то есть пересадки вместе со здоровыми кроветворными клетками клеток опухоли, циркулирующих в крови. Избежать этого возможно при использовании в качестве поддержки кроветворения донорских стволовых клеток.

Кроме того, при трансплантации донорских стволовых клеток развивается феномен трансплантат против болезни, что делает процедуру не просто терапией поддержки, но самостоятельным лечением.





Трансплантационным материалом может являться как периферическая кровь, так и костный мозг, и пуповинная кровь. Преимущества, какого-либо источника стволовых кроветворных клеток, определяются условиями конкретного лечебного учреждения, поскольку у каждого метода имеются достоинства и недостатки (Azouna N.B., et al., 2011; Blume K.G., et al 2000).

Использование донорских стволовых клеток в клинике дало возможность для подробного изучения иммунофенотипических характеристик здоровой кроветворной клетки-предшественницы.

Клетки-предшественницы, появляющиеся в крови больных в период восстановления кроветворения, поврежденного цитостатиками, могут быть определены на основании экспрессии антигена CD34, и по способности образовывать колонии. CD34-позитивные клетки составляют суммарный пул СКК, неоднородность, в пределах которого, иллюстрируется существованием множества колониеобразующих единиц. Общее число CD34+ клеток складывается из КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, кластеробразующих клеток, а также стволовых, би - и унипотентных клеток-предшественниц. В пределах CD34+ СКК существуют минорные субпопуляции не пролиферирующих и не дифференцирующихся клеток, а также наиболее ранние некоммитированые предшественники, обладающих значительным потенциалом к самоподдержанию.

По мере дифференцировки СКК от истинно стволовых до линейно рестриктированных унипотентных происходят изменения мембранного фенотипа клеток. Иммунологический фенотип CD34+ клеток очень точно отражает стадию зрелости стволовой клетки или точнее клеткипредшественницы. На основании экспрессии ряда антигенов на мембране CD34+ можно судить о субпопуляционном составе СКК, то есть о присутствии среди них полипотентных и линейно коммитированных клеток.

В настоящее время имеются достаточно четкие представления о соответствии между уровнем дифференцировки стволовой клетки или клетки-предшественницы и иммунологическим фенотипом ее мембраны (Lanza et al 2001; Seita J., et al., 2010).

Говоря об иммунологическом фенотипе клетки, мы подразумеваем под этим целый спектр антигенов и рецепторных молекул, экспрессируемых, то есть присутствующих на мембране и/или в цитоплазме клетки.

Наиболее ранней стволовой, линейно не рестриктированной (не приобретшей черты какого либо направления дифференцировки) соответствует клетка, экспрессирующая антиген CD34, но отрицательная в отношении экспрессии таких линейно не ограниченных антигенов как HLAHLA-DR и CD38. Рядом исследований показано, что на клетке такого уровня может выявляться слабая экспрессия молекулы Thy-1, большинство из изотипов которой экспрессируются клетками негемопоэтической природы (D’Arena G., et al 1998; Humeau L., et al., 1996; Mayani H., et al., 1994). Таким образом, истинной СКК может удовлетворять иммунофенотип CD34+CD90±HLA-HLA-DR-CD38-.

Стволовым кроветворным клеткам, только вступившим в цикл дифференцировок, инициирующим рост долгосрочных клеточных культур (КИ-ДККM) и формирующим селезеночные колонии у мышей, с точки зрения иммунологического фенотипа могут соответствовать сразу несколько популяций. Экспрессия антигена CD34 на подобных клетках выраженная (CD34++). Среди данных субпопуляций клеток выявляют СКК, отличающиеся по экспрессии антигенов CD38 и HLA-HLA-DR. На части клеток выявляется молекула CD90 и целый ряд работ подтверждает возможность экспрессии пан-миелоидных антигенов CD13, CD33. Однако большинство клеток пула CD13-CD33КИ-ДККМ являются и, возможно, на данном этапе дифференцировки клетка выбирает путь между лимфоидным и миелоидным путем развития (Gaipa G., et al., 2002).

Неоднозначной является экспрессия клетками данного уровня дифференцировки молекулы трансферринового рецептора CD71.

Классически принято относить данный антиген к клеткам-предшественницам эритроидного ростка (Van Dongen J.J., et al., 2012), но, экспрессия данного антигена возможна на активно пролиферирующих кроветворных клетках, ранних этапов дифференцировки.

Именно клетки пула КИ-ДККМ, наряду с истинно стволовыми СКК, способны длительно поддерживать травмированный гемопоэз.

Следующий этап дифференцировки - это уже коммитированные клетки-предшественницы. Данному уровню соответствуют полипотентные СКК, формирующие крупные смешанные колонии гранулоцитов-макрофагов

-мегакариоцитов-эритроцитов (КОЕ-ГЕММ), а также бурст-образующие клетки (БОЕ), полипотентные в отношении миеломоноцитарного и эритроидного (с его преобладанием) ростков. Клетки, формирующие колонии подобного рода, наряду с выраженной экспрессией стволовоклеточного антигена CD34 позитивны в отношении линейнонеограниченных антигенов HLA-HLA-DR и CD38, кроме того, имеют четкие признаки миелоидной направленности дифференцировки (CD13+CD33+).

Возможно существование субпопуляций, различающихся по уровням экспрессии пан-миелоидных молекул. Часть клеток данного пула СКК приобретают черты мегакариоцитарной направленности дифференцировки (CD61+), а также демонстрируют возможность дифференцировки в направлении эритроидного ростка (CD71+CD236a+) (Hoffman R., et al., 1996;

Krause D., et al., 1996; Akashi K., et al., 2000; Azouna N.B., et al., 2011; Babovic S., et al., 2014).

Завершают ряд коммитированных СКК бипотентные (КОЕ-ГМ) и унипотентные (КОЕ-М, КОЕ-Г) миелидно-коммитированные клеткипредшественницы, различающиеся по уровням экспрессии пан-миелоидных антигенов CD13 и CD33. Естественно существует и унипотентный лимфоидно-коммитированный росток. Однако, клетки данных субпопуляций практически не формируют краткосрочных колоний, и изучение СКК данного пула возможно только с применением иммунологических методов.

Именно пул линейно коммитированных (КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕМ, КОЕ-Г) клеток обеспечивает при трансплантации кроветворной ткани достаточно быстрое восстановление как лейкоцитов (в основном, за счет нейтрофилов), так и тромбоцитов (популяция полипротентных КОЕ-ГЕММ).

Детальные сведения о мембранном иммунофенотипе стволовой клетки, а, соответственно, и о субпопуляционном составе пула стволовых кроветворных клеток чрезвычайно важны, как с клинических (прогноз скорости восстановления каждого конкретного кроветворного ростка), так и с фундаментальных позиций (понимание особенностей дифференцировки нормальных клеток крови на ранних этапах кроветворения).

Трансплантация кроветворной ткани, обогащенной стволовыми клетками – это процедура, в ходе которой гемопоэз практически полностью уничтожается химиопрепаратами, а потом воссоздается введением СКК крови или сочетанным введением СКК крови и костного мозга. Цель введения СКК сугубо практическая и состоит в том, чтобы уменьшить, а по возможности свести до минимума побочные эффекты химиотерапии, в первую очередь – летальные исходы, обусловленные инфекционными осложнениями на фоне цитопении.

Основным показателем успеха проведенной аутологичной и аллогенной трансплантации СКК является восстановление показателей крови до уровней, обеспечивающих безопасную или относительно безопасную жизнедеятельность. В силу чего наибольший интерес для клиники представляет субпопуляция линейно коммитированных (в первую очередь, гранулоцитарно-макрофагальных) СКК, в первую очередь, отвечающих на запрос организма, при нарушении кроветворения. Также важны и бипотентные и унипотентные предшественники мегакариоцитов, способные ликвидировать нежелательные последствия тромбоцитопении.

По мере накопления опыта в области трансплантации аутологичных стволовых клеток, появились сведения о возможности существования своего рода фаз в восстановлении показателей кроветворения у больных. В ряде случаев весьма быстрое восстановление уровней лейкоцитов крови сопровождается их последующим падением и повторным медленным восстановлением. Возможны также случаи селективного восстановления кроветворения, при которых длительное время сохраняются изолированные повреждения какого-либо одного ростка гемопоэза (Blume K.G., et al., 2000;

Korbling M., et al., 2011).

По этим причинам врачи и исследователи все чаще задаются вопросом, насколько возможно на основании субпопуляционного состава СКК, циркулирующих в крови больного, или выделенных в процессе лейкафереза (процедура сбора СКК на фоне стимуляции гемопоэза ростовыми факторами), судить о посттрансплантационной скорости и полноте восстановления кроветворения.

Важной представляется оценка особенностей субпопуляционного состава стволовых клеток у пациентов различного возраста, с различными опухолевыми процессами в сопоставлении со здоровыми лицами.

В литературе подобные данные немногочисленны и фрагментарны.

Решение актуальной проблемы детальной иммунологической характеристики стволовых гемопоэтических клеток возможно в крупных научных центрах, имеющих трансплантационные отделения и проводящих иммунологические исследования стволовых клеток.

Таким образом, детальное изучение иммунологических характеристик СКК, позволяющих легко выявлять их субпопуляции является актуальным.

На основании субпопуляционного состава мобилизованных СКК возможна индивидуализация лечения с использованием трансплантации СКК.

Цель исследования - дифференцированный прогноз трансплантации стволовых кроветворных клеток в онкологии на основе их субпопуляционного состава.

Задачи исследования Охарактеризовать субпопуляционный состав линейнокоммитированных и полипотентных стволовых клеток крови онкологических больных и взрослых здоровых лиц на основании экспрессии маркера стволовых клеток CD34, пан-лейкоцитарных антигенов CD45 и CD50, линейно-нерестриктированных молекул HLA-HLA-DR, CD38, CD71 и антигена Thy-1 (ранние СКК) и маркеров линейной дифференцировки – миелоидных CD13, CD33, мегакариоцитарных СD61, эритроидных – гликофорин А и лимфоидных CD7 (Т-клетки) и CD19 (В-клетки).

Провести сравнение гемопоэтического потенциала на основании 2.

субпопуляционного состава стволовых клеток крови онкологических больных в зависимости от возраста (взрослые, дети).

Дать сравнительную характеристику стволовых клеток крови 3.

онкологических больных и здоровых лиц на основании субпопуляционного состава периферических стволовых гемопоэтических клеток.

Определить взаимосвязь мобилизации различных субпопуляций и 4.

нозологической формы заболевания у онкологических больных Выявить клинически значимые субпопуляции СКК, содержание 5.

которых в трансплантируемой ткани отражается на эффективности раннего восстановления лейкоцитов и тромбоцитов крови при аутологичной и аллогенной трансплантации периферических СКК у онкологических больных.

Для решения поставленных задач был изучен широкий спектр наиболее важных, биологически значимых маркеров СКК и сопоставлены эффекты мобилизации и восстановления в зависимости от субпопуляционного состава СКК. Исследованы линейно не рестриктированные молекулы, появляющиеся на самых ранних этапах дифференцировки стволовых гемопоэтических клеток (HLA-HLA-DR, CD38, маркеры миелоидной линии (CD33, CD45, CD50); CD13, CD117);

лимфоцитарные антигены Т-клеток (CD7), В-клеток (CD19, CD10) и NKклеток (CD56, CD57); трансферриновый рецептор (CD71), который, может быть взаимосвязан с пролиферативным потенциалом СКК. Кроме того, мы попытались охарактеризовать популяцию истинно стволовых кроветворных клеток на основании отсутствия экспрессии линейно-неограниченных молекул HLA-HLA-DR, CD38 и экспрессии антигена Thy-1 (CD90).

Особое внимание уделено изучению феномена экспрессии на стволовых клетках общелейкоцитарного антигена поскольку CD45, сочетание уровней экспрессии только двух антигенов CD45 и CD34 дает представление об уровне дифференцировки СКК.

Научная новизна и практическая значимость Впервые, на большом клиническом материале (1187 образцах кроветворной ткани у 430 онкологических больных разного возраста и у 50 взрослых доноров аллогенной кроветворной ткани, наблюдающихся в отделениях ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина») подробно охарактеризован мембранный иммунофенотип мобилизованных периферических стволовых кроветворных клеток.

Показано, что субпопуляции стволовых кроветворных клеток различных этапов дифференцировки и линейной коммитированности, обуславливающие полноту восстановления гемопоэза и отдельных ростков крови, могут быть оценены проточно-цитометрически в материале трансплантации онкологических больных.

Описаны уникальные иммунофенотипы наиболее ранних – КИ-ДККМ, КОЕ-ВПП – CD34+CD38-HLA-DR-, CD34+Thy1+ CD71±, плюрипотентные, КОЕ-ГЕММ – CD34+CD38±HLA-DR±Thy-1+CD117+CD71±CD61±lymph±myel±, обеспечивающие полноту восстановления. Изучены бипотентные КОЕ-ГМ – CD34+CD38+HLA-DR+CD117+myel± lymph-, БОЕ-ЕМег - CD34+CD38+HLADR+CD117+myel± CD71+CD61±lymph-, унипотентные–миелоидные CD34+CD38+HLA-DR+CD117±myel+ lymph-.

Установлена вероятность мобилизации в периферическое русло субпопуляции, которая, иммунофенотипически, соответствует общему лимфоидному предшественнику - CD34+CD38+HLA-DR+CD90±CD10±myel-.

Выявлена вероятность мобилизации в периферическое русло субпопуляции CD34+CD45neg клеток, гетерогенных по размеру и в отношении экспрессии остальных изучаемых маркеров СКК. Установлены иммунофенотипические отличия данных клеток у доноров и онкологических больных.

У доноров аллогенной трансплантации установлена возможность Т/NK CD34+CD38-HLA-DRклеточной рестрикции клеток на основании коэкспрессии антигена при отсутствии маркеров миелоидной CD7, рестрикции. У детей с онкогематологической патологией среди клеток субпопуляции CD34+CD38-HLA-DR- вероятно присутствие CD19+, CD2+ и CD56+ СКК.

Подтверждена эффективная мобилизация бипотентных миелоиднокоммитированных СКК, гетерогенных в отношении экспрессии панмиелоидных антигенов CD13, CD33. Среди СКК взрослых больных, CD13+, содержащих менее 70,0% миелоидных предшественников вероятность коэкспрессии пан-миелоидных антигенов CD33 и CD13 на уровне одной СКК была низкой (р=0,012).

Аутологичные СКК и детей и взрослых демонстрировали гетерогенность в отношении с-kit рецептора. У взрослых онкогематологических больных показана взаимосвязь CD117low СКК и CD19+ CD117++ CD33+ СКК, и СКК. У детей возможно существование субпопуляции CD117low lymph+ (CD19 и CD7). Установлена наиболее выраженная мобилизация CD34+CD117+ СКК у онкологических больных (р=0,029).

Аутологичные и аллогенные СКК демонстрировали неоднородность экспрессии рецептора трансферрина CD71. Среди аутологичных СКК детей прослежена закономерность – CD34+CD71low клетки были CD13++, и экспрессировали стволовоклеточный антиген более ярко в сравнении с CD71++, которые в большинстве были CD13-негативными.

Показано, что мегакариоцитарно-рестриктированные СКК - четкая отдельная популяция CD34+CD61+ СКК, большинство из которых CD45neg Thy-1- mуеl+.

Выраженное количество лимфоидно-коммитированных предшественников – редкая ситуация как у взрослых так и у детей (менее 10% случаев).

Большинство СКК с экспрессией CD19 у детей и у доноров могут быть описаны как клетки небольшого размера, с иммунофенотипом CD34+HLADR+myel-CD71+CD10±CD90+CD45+ (пре-пре-В, про-В этапы костномозговой дифференцировки).

У взрослых вероятность коэкспрессии CD19, CD10, CD45 мала, и большинство CD19+СКК были CD45lowCD10- (про-В этап).

Выявлена мобилизация достаточно гетерогенной популяции CD34+CD7+ СКК. Среди аутологичных CD7+ СКК и детей и взрослых CD7+CD45+ показана возможность присутствия СКК с экспрессией миелоидных антигенов (миелоидно-коммитированные предшественники, биплюрипотентные) и CD7++CD45lowHLA-DR-CD38- СКК – являющиеся, с высокой долей вероятности, Т-линейными предшественниками.

Установлена клиническая значимость субпопуляций СКК при аутологичной и аллогенной трансплантации мобилизованных периферических клеток в отношении восстановления кроветворения в ранний посттрансплантационный период у онкологических больных.

У взрослых онкологических больных выраженная пропорция субпопуляций CD45low, CD45-, и менее 70,0% CD34+CD33+ СКК отражала более эффективное восстановление кроветворения (р0,05).

У детей с онкогематологической патологией присутствие большего количества CD45low, выраженная пропорция CD34+CD38+ СКК, менее 90,0% CD13+CD34+ СКК характеризовало группу с более быстрым восстановлением кроветворения (р0,04).

У реципиентов аллогенных СКК, полученных от взрослых родственных доноров, в детской онкогематологической практике выраженная пропорция CD45neg СКК, и менее 90,0% CD13+CD34+СКК, обеспечивали более быстрое восстановление кроветворения. Задержка в сроках восстановления лейкоцитов ассоциировалась с повышенным содержанием среди трансплантируемых СКК субпопуляции CD34+CD7+ (р=0,022).



Показана взаимосвязь части клинически значимых субпопуляций с CD34+ суммарной дозой СКК (общее количество клеток) в трансплантируемой ткани.

У взрослых онкологических больных СКК лейкаферезных продуктов, содержащих менее 1,0% CD34+ клеток, демонстрировали более высокое содержание CD34+CD45low (р=0,039), CD34+CD38+ (р=0,023), CD34+CD33+ (р=0,026) и CD34+CD7+ (р=0,045) СКК.

У детей среди ЛП, содержащих менее 2,0 х106/ кг СКК, достоверно более низким в сравнении с ЛП, содержащими 2,0 х106/ кг СКК, было относительное (%) количество CD13+ (р=0,013), CD71+ (р=0,002). Количество CD45low(р=0,0001), CD38-HLA-DR- СКК (р=0,021) и CD61+ (р=0,045) субпопуляций СКК было более высоким.

Среди донорских СКК при содержании в ЛП 0,2% и более CD34+ СКК достоверно более высоким было количество (%) CD45low (р=0,03), CD45HLA-DR+ (р=0,013), CD50+ (р=0,038) СКК. Количество CD34+CD33+ клеток в образцах с содержанием 0,2% и более СКК было напротив достоверно более низким (р=0,023).

Выявлены, не взаимосвязанные с суммарной дозой CD34+ клеток, клинически значимые субпопуляции СКК.

При аутологичной трансплантации у взрослых онкогематологических больных CD34+CD45low СКК, независимо от суммарной дозы СКК, опосредовали скорость восстановления, как лейкоцитов, так и тромбоцитов, а CD34+CD90+СКК опосредовали скорость восстановления тромбоцитарного звена.

При аутологичной трансплантации у онкологических больных детского возраста независимыми от суммарной дозы СКК являлись CD34+CD38- СКК, опосредующие скорость восстановления лейкоцитов и CD34+HLA-HLA-DR+ СКК, количественно опосредующие скорость восстановления тромбоцитарного звена.

При аллогенной частично-родственной трансплантации мобилизованных периферических СКК в детской онкогематологической практике (трансплантация клеток от взрослых доноров) независимой от суммарной дозы СКК, количественно значимой, явилась субпопуляция CD34+CD13+ СКК.

Установлена взаимосвязь иммунофенотипа мобилизованных периферических аутолдогичных СКК с нозологической формой и выявлена разница в эффекте мобилизации клинически значимых субпопуляций.

У взрослых онкогематологических больных наилучший эффект мобилизации на основании суммарного количества CD34+СКК в материале первого дня сбора отмечен в случае НХЛ и ММ в сравнении с ЛХ (р=0,01).

СКК ЛП больных с множественной миеломой характеризовались более выраженной пропорцией В-линейных CD19+ СКК, тогда как количество CD34+CD45neg клеток было достоверно более низким в сравнении с группой ЛХ, различия были обусловлены и CD45- (р=0,023) и CD45low(р=0,016) СКК.

У больных ММ среди СКК выявлено преобладание CD34+HLA-DR+ и CD34+CD38+ субпопуляций, в сопоставлении с группой больных неходжкинскими лимфомами.

У детей наилучший эффект мобилизации выявлен для группы больных СЮ и нейробластомы, в группе больных с медуллобластомой и гемобластозами эффект мобилизации был выражен слабее (р=0,03). У больных гемобластозами среди СКК выявлялось наибольшее, в сравнении с остальными группами больных (ОССЮ, гемобластозы, мягкотканные опухоли, медуллобластома), количество субпопуляций CD45neg (р0,034, для всех групп сравнения) и количество CD34+CD117+ СКК (р0,016, для всех групп сравнения).

Наибольшее содержание CD34+CD38- СКК отмечено в ЛП у детей, больных медуллобластомой, самым высоким для данной группы было количество Thy-1+ СКК (р0,03 для все групп сравнения). Для СКК больных медуллобластомой выявлено более низкое количество CD34+CD117+ и CD34+CD33+ СКК (р0,01, для всех групп сравнения). СКК больных ПНЕО, отличало более выраженное количество CD34+HLA-DR-CD38- СКК и практически сопоставимое с группой медуллобластом количество Thy-1+ СКК (р=0,001 для всех групп, за исключением медуллобластомы). Также выраженной у больных ПНЕО, в сопоставлении с остальными группами детей оказалась пропорция В-линейных предшественников CD19+ (p0,038, для всех групп сравнения).

Практические рекомендации.

Характеристика СКК при аутологичной и аллогенной 1.

трансплантации ткани в онкологической практике должна включать не только подсчет суммарного количества CD34+клеток, необходима оценка субпопуляционного состава.

С целью улучшения непосредственных результатов 2.

трансплантации СКК в онкологии, необходима количественная оценка ранних субпопуляций СКК CD34+CD45neg, CD34+ CD90+, CD34+CD38- и коммитированных СКК (мегакариоцитарные CD34+CD61+, миелоиднокоммитированные CD34+CD13+CD33+).

Для выявления клинически значимых субпопуляций у взрослых 3.

онкогематологических больных может быть предложена следующая комбинация МКА CD34\CD45\CD33\CD7\CD90.

В условиях детской клиники при прогнозе эффекта аутологичной 4.

трансплантации СКК необходима иммунофенотипическая характеристика трансплантируемых СКК на основании сочетания CD34\CD45\CD38\CD13.

При оценке эффекта аллогенной трансплантации СКК следует 5.

оценить совокупность экспрессии CD34,CD45,CD13, CD7, CD90.

Учитывая высокую частоту выявления субпопуляций CD45neg 6.

СКК как у взрослых онкогематологических больных, так и у детей и её клиническую значимость при трансплантации целесообразна цитометрическая оценка суммарного количества СКК в

–  –  –

В ходе выполнения работы получен патент на изобретение Л.Ю.

Гривцова, Н.Н. Тупицын «Способ количественного определения клетокпредшественников (CD34+) в кроветворной ткани» РФ № 2513511.

Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделений трансплантации и химиотерапии гемобластозов НИИ ДО и Г и НИИ КО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», а так же клинических подразделений ГВКГ им. Академика Н.Н. Бурденко и ФГБУ НМХЦ им. Н.И. Пирогова.

Глава I. Литературный обзор Стволовые кроветворные клетки Введение 1.1 Аутологичная и аллогенная трансплантация стволовых кроветворных клеток (CКК) обеспечивает замену и/или восстановление нарушенного, патологического кроветворения и широко используется в клинической онкологической практике у больных на фоне применения высоких доз цитостатиков и/или облучения. Эффективность трансплантации СКК показана при широком спектре нозологий, включающих онкогематолгические заболевания и ряд солидных опухолей, а также врожденных или приобретенных патологий костного мозга. В большинстве случаев (86% аутологичных трансплантаций в Европе) это - трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток, мобилизованных воздействием ростовых факторов. Количество стволовых кроветворных клеток в трансплантате определяет клинический эффект, то есть скорость и полноценность восстановления травмированного кроветворения [79, 160, 199, 266, 277].

Стволовые кроветворные клетки (СКК) – очень малочисленная, но гетерогенная клеточная популяция, объединяющая в себе несколько типов (субпопуляций) клеток, отличающихся по уровням дифференцировки и способности к пролиферации. Среди них присутствуют как недифференцированные, практически не делящиеся стволовые клетки (СК), так и коммитированные (ограниченные в направлении дифференцировки) клетки-предшественники [13, 249, 275].

Популяция стволовых кроветворных клеток среди всех СК была идентифицирована первой. Её изучение сыграло ключевую роль в понимании биологии и функций стволовых клеток в целом [25, 105, 251, 268, 295, 319, 351].

Любую клетку из пула стволовых, в том числе и СКК, характеризует ряд особых свойств: СК способны к самообновлению/самовосстановлению на протяжении длительного времени или даже в течение всей жизни организма (long –term subset).

Стволовые клетки, обладающие способностью к самовосстановлению, находятся в состоянии клеточного цикла, так называемые G0/G1 «покоящиеся» стволовые клетки [124, 145]. Процессы пролиферации и дифференцировки СК запускаются при необходимости (нарушения целостности организма любого генеза). Стволовые клетки могут дифференцироваться в специализированные клетки организма (по крайнее мере 2-х фенотипов), данное свойство СК приобретают на этапе кратковременно живущего пула неспециализированных коммитированных СК, которые переходят в G1 фазу клеточного цикла [319].

По мере дифференцировок и приобретения клеточной специализации СК постепенно утрачивают способность к самовосстановлению и снижают потенциал пролиферации, а возможность дифференцировок ограничивается одним типом клеток.

СК обладают способностью делиться ассиметрично, то есть при пролиферации образуются 2 дочерние клетки. Одна из которых приобретает свойства коммитированного предшественника, способного к узконаправленной дифференцировке, восполняющего клеточные потери организма. Другая остается неспециализированной, и составляет так называемый резерв. Это их свойство позволяет сохранять целостность организма на протяжении всей жизни и обеспечивать стабильность системы кроветворения. Соблюдение баланса между механизмами пролиферации и дифференцировки опосредуется взаимодействием целого ряда факторов, в том числе и белков клеточной мембраны самой СК и её микроокружения [75, 319].

Грань между различными субпопуляциями СКК (наиболее ранними долгоживущими и дифференцирующимися коммитированными) является достаточно тонкой, размытой и определить её не всегда возможно.

Определенные успехи в выделении различных субпопуляций СКК, а также и популяций СК других специфичностей были достигнуты в результате характеристики их мембранного иммунофенотипа.

Иммунологический профиль любой клетки может быть определен с использованием методов многоцветной проточной цитометрии. Применение различных комбинаций мембранных антигенов при характеристике СКК с наибольшей точностью позволяет охарактеризовать уровень дифференцировки клеток, а также опосредовано определять степень пролиферативной и репопулирующей способности СКК, выделять различные субпопуляции. Каноническим для оценки количества СКК кроветворной ткани является метод проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к антигену CD34 [201]. В случае трансплантации кроветворной ткани у онкологических больных именно количество CD34+клеток и число их различных субпопуляций определяет эффективность восстановления кроветворения в целом и полноценность функционирования различных звеньев иммунной системы в частности.

Накоплены огромные знания относительно биологии стволовых клеток (СК), как кроветворных, так и стволовых клеток других специализаций, разработаны конкретные программы практического использования стволовых клеток в медицине. [13, 24, 75, 199].

Особый интерес вызывали и вызывают методы клеточной трансплантации как собственно терапевтическое воздействие, и, соответственно интерес к изучению столовых клеток крови не ослабевает до сих пор.

История изучения и современная концепция стволовых 1.2 клеток XXI век, век биотехнологий можно с успехом назвать и веком регенеративной медицины. В 2012 году нобелевская премия была присуждена японскому ученому С.Яманака (получение стволовых клеток из обычных клеток организма – индуцированные стволовые клетки iPS) и британскому биологу Д. Гердону за работы по стволовым клеткам и клонированию животных [269, 364]. Этот факт не столько подвел своеобразную черту под многолетними изучениями стволовых клеток, сколько дал толчок к их дальнейшему изучению.

Термин стволовой кроветворной клетки впервые был озвучен практически два столетия назад российским ученым Александром Максимовым [3]. Но начало формирования концепции стволовых клеток было положено 50 лет назад канадскими учеными J.E. Till и Е.А McCulloch (A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res., 1961, V. 14, p. 213-222) в результате работ по изучению регенерации кроветворной системы смертельно облученных животных [375].

Было описано формирование селезеночных колоний у мыши, подвергшейся сингенной трансплантации. Анализ этих клеточных колоний выявил в донорском костном мозге малочисленную клеточную популяцию, обладающую 2-мя замечательными свойствами: генерация множественных типов эритро-миелоидных клеток и способность, названная саморепликацией [242, 338, 375, 404]. Установлена способность кроветворных клетокпредшественниц, образовывать в организме или культуре колонии-клоны, возникающие из одной клонообразующей клетки [244, 351].

Таким образом, было показана гетерогенность пула СКК и положено начало изучению различных типов СКК на основании способности к формированию клеточных колоний in vitro и in vivo, в дальнейшем послужившего основой формирования схем кроветворения, не потерявших своей актуальности и до сих пор.

В 70-х годах прошлого столетия были охарактеризованы плюрипотентные СКК, способные к самоподдержанию, обеспечивающие стойкое, длительное восстановление кроветворения. Данные клетки репопулировали костный мозг смертельно облученных животных, имели высокий потенциал пролиферации и были способны к дифференцировке по всем направлениям гемопоэза. [40-42, 179, 180, 244, 291].

В культуральных системах in vitro популяцию наиболее примитивных гемопоэтических клеток-предшественниц на начальных этапах дифференцировки в настоящее время отождествляют с клетками, инициирующими долгосрочную культуру клеток костного мозга (КИ-ДККМ) и культуру клеток с высоким потенциалом пролиферации (КОЕ-ВПП) [37, 38, 49, 221, 358]. Мышиные КОЕ-ВПП способны восстанавливать костный мозг летально облученных мышей [249]. Аналогичная популяция выявлена в эмбриональной печени и пуповинной крови человека [4, 230, 231, 253].

Отработка методов культивирования кроветворных предшественников в краткосрочной культуре вязких сред с добавлением ростовых факторов дала возможность изучать коммитированные гемопоэтические предшественники – клетки, имеющие определенную направленность дифференцировки. Общая предшественница всех линий гемопоэза с высоким пролиферативным потенциалом - олигопотентная КОЕ-ГЕММ. Данные клетки гетерогенны по размеру и составу, потенциал пролиферации у большей части чрезвычайно высок. Грань между КОЕ-ГЕММ и более ранними стволовыми кроветворными клетками несколько размыта, возможно, часть клеток, формирующих такие колонии, может быть отнесена к разряду наиболее ранних [6, 13, 219]. В культуре КОЕ-ГЕММ образует смешанные колонии, в их составе обнаруживаются гранулоциты, эритроидные клетки, мегакариоцты и макрофаги [73]. Клетки именно этого пула восполняют при необходимости все ростки гемопоэза.

Бипотентные/олигопотентные клетки-предшественники относятся к разряду коммитированных в отношении миелоидного ростка, способных дифференцироваться по двум направлениям. К данному классу клеток– предшественниц относят КОЕ-ГМ колониеобразующие единицы гранулоцитов макрофагов, а также БОЕ-Э/Мег общий

-ранний предшественник эритроцитов и мегакариоцитов. Основное отличие БОЕЭ/Мег от КОЕ-ГЕММ заключается в отсутствии среди БОЕ-Э/мег клеток, обеспечивающих рост гранулоцитарных колоний [45, 87, 119].

С точки зрения характеристики трансплантационного материала именно данный класс предшественников имеет наибольшее значение. КОЕГМ определяет быстрое восстановление нейтрофильного звена, тогда как БОЕ-Э/Мег обеспечивают восполнение гемопоэза тромбоцитами и формируют красный росток.

Унипотентные клетки предшественницы: клоногенные предшественники гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М). Все клетки класса унипотентных обладают низкой способностью к самоподдержанию и готовностью быстро пролиферировать, обеспечивая быстрое восстановление определенного (каждая единица лишь одного) ростка гемопоэза.

В результате многочисленных исследований постепенно формировалась современная концепция стволовых клеток.

С точки зрения происхождения в настоящее время различают 3 группы СК – эмбриональные\ фетальные, взрослые, соматические (иногда употребляется термин региональные) стволовые клетки и недавно полученные in vitro – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPs). Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), клетки дающие начало всем тканям организма в эмбриональном периоде, были впервые выделены посредством in vitro фертилизации преимплантационного бластоцита [111, 282, 343, 374] ЭСК обладают высокой теломеразной активностью, неограниченным потенциалом пролиферации и широкими возможностями к дифференцировке. ЭСК являются идеальным объектом клеточной терапии, но их терапевтический потенциал и исследования сдерживаются этическими аспектами, а также возможной онкогенной активностью в случае их трансплантации [128, 325, 366].

Взрослые, региональные стволовые клетки (РСК, Adult stem cells), иногда называемые термином соматические стволовые клетки, обнаруживаются во многих тканях взрослого организма (костный мозг, кости, кожа, кровеносные сосуды, мышцы) в виде редких включений [167, 295]. РСК трудно идентифицировать морфологически. Как и ЭСК, РСК относят к числу недифференцированных клеток, которые репопулируют (самовосстанавливаются) циклично в течение длительного времени.

Дифференцировка РСК идет в клетки той ткани, в которой они содержатся, [23]. За счет этого поддерживается физиологическая регенерация различных тканей.

Возможно в условиях экстремальных ситуаций (повреждение ткани) РСК могут приобретать мультипотентные свойства, или так называемую пластичность, и дифференцироваться в другие типы клеток, имеющие общность эмбрионального лепестка происхождения [347].

Более доступными для выделения и изучения в настоящее время остаются РСК, полученные из кроветворной ткани. Кроветворная ткань содержит соматические стволовые клетки двух типов: мезенхимальные стволовые клетки (МСК), или иначе стромальные стволовые клетки и стволовые кроветворные клетки (СКК). МСК были впервые описаны в России в 1974 году [126]. Дальнейшие изучения in vitro продемонстрировали присутствие среди МСК различных клеточных типов. Были описаны мультипотентные клетки-предшественники (multipotent adult progenitor cells), нерестриктированные соматические стволовые клетки и стволовые клетки, способные быстро восстановить самое себя (rapidly self-renewal cells, RS) [74, 75, 78, 196, 304].

Соотношение МСК и СКК в кроветворной ткани варьирует в зависимости от возраста организма. Так, если сразу после рождения в костном мозге на 10 000 СКК приходилась 1 МСК, то в подростковом возрасте этих МСК становиться уже в 10 раз меньше, к 50-ти годам 1 стромальная стволовая клетка приходится на 500 000 гемопоэтических стволовых клеток. [298, 344].

В течение жизни количество взрослых стволовых клеток всех специализаций в организме прогрессивно уменьшается. Если в зародыше, на стадии органогенеза практически половина всех клеток приходится на некоммитированные СК, то уже в фетальной печени 1 СКК приходится на зрелых клеток. В кроветворной ткани человека 1 недиференцированная «истинно» стволовая клетка приходится на 2-10 млн.

клеток различной степени дифференцировки [36, 358].

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPs), получены совсем посредством генетического репрограммирования соматических диффренцированных клеток в недифференцированные клетки по статусу сходные с ЭСК [269, 364]. iPs клетки дают возможность получения аутологичных плюрипотентных клеток из различных тканей взрослого организма. Они являются оптимальным объектом клеточной инженерии и фундаментальных исследований, как в области изучения и понимания патогенеза различных заболеваний путем искусственного модулирования процессов, так и с точки зрения разработки новых лекарственных препаратов. В настоящее время человеческие iPs успешно получены из клеток кожи, кератиноцитов и волосяных фолликулов, в том числе и без вовлечения ДНК, а также из клеток крови и различных тканей, полученных у пациентов в ходе проведения хирургических операций [8, 189, 228].

Несмотря на множество исследований, подтверждающих возможность широкого клинического применения iPs, в этой области остается много вопросов и серьезных проблем (методы репрограммирования, использование в качестве векторов доставки транскриптов ретровирусов). Высока вероятность инсерционного мутагенеза, что может привести к развитию неопластических процессов у будущего потомства [109].

С возрастом клоногенный потенциал и пролиферативная активность РСК и СКК, в частности, значительно снижаются. По мере старения организма (продемонстрировано у человека и на мышиных моделях) происходит смена соотношения различных субпопуляций стволовых кроветворных клеток, снижается количество наиболее ранних форм и количество лимфоидных предшественников, наряду с возрастанием количества миелоидных клеток-предшественников [64, 65, 207, 275, 310, 358, 387]. Данные возрастные изменения в биологии стволовых клеток находят и клиническое отражение, в частности увеличение трансплантационной смертности (TRM) при аллогенной трансплантации СКК демонстрирует прямую зависимость от возраста доноров [197].

Установлено, что количество CD34+ клеток костного мозга снижается в старших возрастных группах, однако количество наиболее ранних СКК CD34+CD38- среди них напротив возрастает [367, 394]. Данные количественные изменения в совокупности с функциональными изменениями обуславливают преобладание у взрослых и пожилых людей миелоидных форм лейкозов, а так же высокую частоту развития анемий в старших возрастных группах [275, 358, 367б 387].

Методы идентификации СКК. Мобилизованные СКК.

1.3 По мере совершенствования методов селекции клеток и накопления знаний об экспрессии различных мембранных молекулярных маркеров, выявляемых методами проточной цитометрии, иерархическая модель СКK была расширена и дополнена [319].

Начало исследованиям в отношении изучения иммунофенотипического профиля (экспрессии различных дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека на мембране клетки) СКК было положено с момента открытия их специфической мембранной детерминанты и подробного описания – антигена CD34 [18, 69, 185, 201, 236].

Наиболее активно иммунофенотип субпопуляций СКК может быть оценен только в пределах фракций клеток, вступивших в цикл дифференцировок и приобретших на мембране визуализируемое количество рецепторов (уровень от КОЕ-ГЕММ до унипотентных СКК).

Вопрос идентификации наиболее ранних некоммитированных СКК (клетки с высоким потенциалом пролиферации и клетки, инициирующие рост долгосрочных клеточных культур) оказался более сложным, поскольку экспрессия большинства линейноспецифичных (lin) и линейнонеограниченных маркеров (HLA-DR, CD38, CD71, CD45, CD50 и других) на популяции ранних СКК отсутствует. Истинно стволовая клетка является высокометилированной, а активность митохондрий мультипотентных стволовых клеток крайне низкая, что соответствует G0 фазе клеточного цикла [174, 201, 212, 377, 402].

Для изоляции пула ранних СКК используют их свойство удерживать\накапливать в незначительных количествах родамин 123 флуоресцентные частицы, которые связываются с (Rho123) активированными митохондриями, что отражает метаболический статус клетки [37, 38, 190, 381, 412]. В первых экспериментах попытки изолировать фракцию плюрипотентных функционально активных СКК, репопулирующих костный мозг иммунодефицитных мышей на основании количества родамина 123 оказались неудачными. Методики были усовершенствованы и подтвердили, что большинство клеток из фракции ранних СКК могут быть охарактеризованы как CD34+RholowLin- клетки [40-42, 78].

Выделение мультипотентных СКК возможно с использованием флуоресцентных красителей Hoechst 33342, дериватов бисбензимидазола. С точки зрения изоляции примитивных СКК достаточно точным является сочетание двух упомянутых флуоресцентных красителей Rho123 и Hoechst 33342. Краситель способен пермеабилизировать клеточную Hoechst мембрану и связываться с нуклеиновыми кислотами. Уровень эмиссии флуоресценции чётко отражает свойства ДНК, как то хромосомные реаранжировки, конформацию ДНК и состав нуклеиновых кислот. Данный краситель используется в проточной цитометрии для оценки плоидности ДНК и статуса клеточного цикла в пределах гетерогенных клеточных популяций, например, среди клеток костного мозга [404].

На основании незначительной флуоресценции (Hoechstlow) выявляется так называемая side population (SP) – минорная фракция стволовых клеток с высокой репопулирующей способностью [59, 142, 143, 278, 399].

В ходе последних десятилетий стратегии изоляции СКК и оценки клонногенной активности in vivo активно развивались. При трансплантации ограниченных доз СКК костного мозга, облученным животным подтверждена гетерогенности СКК в отношении их репопулирующей активности, способности к самовосстановлению и к формированию колоний клеток in vitro [10, 40-42, 107, 108, 254, 255, 332, 363, 383].

Каноническим методом выявления и количественного подсчета СКК в клинической практике является проточная цитометрия [2, 33-35, 93. 138, 147На основании комбинации моноклональных антител к нескольким антигенам, возможно с высокой специфичностью (более 95%) выявить стволовые клетки и оценить их количество в любой ткани. Использование многоцветной проточной цитометрии позволяет оценить и гетерогенность стволовых клеток, охарактеризовать их так называемые субпопуляции. Это принципиальный момент, поскольку именно количество СКК и их субпопуляционный состав, определяют эффективность трансплантации кроветворной ткани [181, 211, 292-294].

Незадолго до открытия мембранной детерминанты стволовых клеток, антигена CD34, был впервые описан феномен мобилизации. Обнаружено кратковременное повышение уровней (всего лишь в 2-4 раза) кроветворных клеток–предшественников в периферическом русле под воздействием сульфата декстрана у собак, а так же эндоксана и адренокортикотропина у здоровых доноров. Это повышение уровней СКК было незначительным (всего лишь в 2-4 раза), и оказалось кратковременным [29, 70].

В настоящее время под клиническим термином «мобилизация»

подразумевается выход значительного количества СКК в периферическое русло под влиянием воздействия химиорепаратов и\или цитокинов. Этот процесс повторяет физиологически обусловленное высвобождение предшественников из специальных ниш костного мозга в ответ на сигнальный каскад, запускаемый стрессом, воспалением и любым повреждением [303].

Феномен мобилизации опосредуется способностью СКК мигрировать из периваскулярных ниш костного мозга в периферическую кровь, лимфатические и экстрамедуллярные органы и снова возвращаться в костный мозг, данное их свойство называют рециркуляцией [406].

Переход большего количества СКК в активное состояние- G1 требует внешних воздействий, необратимость данного процесса в настоящее время обсуждается. Возможно, часть СКК возвращается в состояние покоя, однако статус такой клетки уже не равноценен исходной, и, при необходимости восполнения кроветворной системы, она реагирует сразу, более быстро поступая в периферическое русло, чем исходная G0 СКК. Такая клетка приобретает маркеры определенных линий дифференцировки в культуре в течение 1-2 дней против 14 дней для исходной СКК [26, 27, 124, 145, 206, 212, 300, 361-363, 379].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 12 |
Похожие работы:

«ПРОТОКОЛ № 4 от 24.02.2015 г. заседания диссертационного совета Д 001.036.01 на базе НИИ кардиологии Председатель: академик РАМН Карпов Р.С. Ученый секретарь: д.м.н., проф. Ворожцова И.Н. Присутствовало 23 члена диссертационного совета (см явочный лист). Повестка заседания: принятие к защите диссертации Сазоновой Светланы Ивановны на тему «Гамма-сцинтиграфическая визуализация воспалительных поражений сердца: методология и проблемы топической диагностики» на соискание ученой степени доктора...»

«ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА доктора медицинских наук, профессора, заведующего кафедрой анатомии человека государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России Железнова Льва Михайловича на диссертационную работу аспиранта кафедры анатомии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Мариям Джашаровны Боташевой на тему: «Морфологическая характеристика вен системы...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Факультет нанои биомедицинских технологий СОГЛАСОВАНО УТВЕРЖДАЮ Заведующий кафедрой Декан _ _ 2015 г. 2015 г. Фонд оценочных средств текущего контроля и промежуточной аттестации по дисциплине Интеллектуальные материалы для капсулирования и адресной доставки лекарств Направление подготовки 22.04.01 Материаловедение и технологии материалов Профиль подготовки...»

«ПСИХОСОМАТИЧЕСКИЕ РАССТРОЙСТВА В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ Под ред. акад. РАН А.Б.Смулевича Москва «МЕДпресс-информ» УДК 616.89 ББК 56.14 П86 Все права защищены. Никакая часть данной книги не может быть воспроизведена в любой форме и любыми средствами без письменного разрешения владельцев авторских прав. Авторы и издательство приложили все усилия, чтобы обеспечить точность приведенных в данной книге показаний, побочных реакций, рекомендуемых доз лекарств. Однако эти сведения могут изменяться....»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Северный государственный медицинский университет НУТРИЕНТНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ЧЕЛОВЕКА Монография Под редакцией доцента А.Н. Плакуева, профессора А.Л. Санникова Архангельск УДК 616-085.874 ББК 53.51 Н 90 Коллектив авторов: О.В. Буюклинская, доктор медицинских наук, доцент, заведующая кафедрой фармации и фармакологии СГМУ; Л.А. Заросликова, кандидат медицинских наук, доцент кафедры общественного здоровья и здравоохранения; О.Г. Струсовская, кандидат...»

«Чесотка Доктор медицинских наук Павел Конрад Дерматологическая клиника Добричовице/Лазермед Введение Чесотка – зудящий дерматоз, это всемирно распостраненное заболевание, вызванное Sarcoptes scabiei variatio hominis, или просто – чесоточным клещем. Многие ошибочно предполагают, что такая болезнь встречается редко. Но, даже сегодня, эта болезнь встречатеся очень часто в дерматологической практике и даже занимает первое место среди профессиональных дерматозов в Чешской Республике! История Первое...»

«Винокуров Иван Андреевич ОБОСНОВАНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО АЛГОРИТМА ПРИМЕНЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ЗАЩИТЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПОЧЕК ПАЦИЕНТА ПРИ ОПЕРАЦИЯХ НА ДУГЕ АОРТЫ 14.01.26 сердечно-сосудистая хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА – 2015 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова»...»

«ЛАБОРАТОРИЯ МЕДИКО-ФИЗИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ЛАЗЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского д.т.н., зав. лабораторией, Рогаткин Д.А. Государственное учреждение Московский областной научноисследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского (ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского) – один из старейших и крупнейших научно-исследовательских медицинских центров в нашей стране. Достаточно сказать, что первым предшественником МОНИКИ был противочумный карантин – «Карантинный дом», созданный в...»

«Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования (СПбМАПО) История успеха клиента «ВитаСофт» (решение VS требовалась полностью интегрированная, комплексная информационная Clinic) ПОЧЕМУ VS CLINIC «Нам система, охватывающая все аспекты деятельности СПбМАПО. Система, которая позволяла бы эффективно управлять. Решение VS Clinic на сегодняшний момент является, пожалуй, единственным в России, полностью отвечающим требованиям комплексного управления в медицинских учреждениях,...»

«9 Клиническая и профилактическая медицина УДК 616.33-089.87 ББК Р457.445.22-86-7 В.Е. ВОЛКОВ, С.В. ВОЛКОВ, Н.Н. ЧЕСНОКОВА ОСОБЕННОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ И ЛЕЧЕБНОЙ ТАКТИКИ ПРИ ЛОКАЛЬНЫХ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЯХ ОСТРОГО НЕКРОТИЧЕСКОГО ПАНКРЕАТИТА В СВЕТЕ НОВОЙ МЕЖДУНАРОДНОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА – 2012 Ключевые слова: острый некротический панкреатит, локальные осложнения, полиорганная недостаточность. Изучена степень тяжести острого панкреатита у 461 больного, находящегося...»

«ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертационную работу Должанского Олега Владимировича «Судебно-медицинская оценка острой кровопотери по морфофункциональным изменениям внутренних органов», представленную на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.05 «судебная медицина» Актуальность темы Одной из актуальных проблем судебно-медицинской науки и практики является проблема диагностики острой кровопотери. Особые трудности, как известно, у судебно-медицинских экспертов...»

«Памятка гражданам Украины, вынужденно покинувшим свою страну, Барнаул, 2014 г. Брошюра подготовлена к печати и издана Региональной общественной приемной Председателя Партии «ЕДИНАЯ РОССИЯ» Д.А.Медведева в Алтайском крае совместно с Управлением Федеральной миграционной службы по Алтайскому краю, Отделением Пенсионного фонда Российской Федерации по Алтайскому краю и Алтайским региональным отделением Фонда социального страхования РФ. Брошюра издана с целью оказания информационной и методической...»

«Отзыв официального оппонента на диссертацию Киясовой Елены Валерьевны «Становление и развитие кафедр анатомии и гистологии Казанского университета» представленную на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 07.00.10. – история науки и техники (медицинские науки) Актуальность избранной темы. Российское высшее (университетское) образование развивалось на основе немецкой (Гумбольтовской) модели высшей школы. В то же время, следует отметить, что это не был процесс...»

«РЕЗУЛЬТАТЫ ИНТРОДУКЦИИ БРУСНИКИ В КОСТРОМСКОЙ ОБЛАСТИ Тяк Г. В., Черкасов А. Ф., Алтухова С. А. Лесная опытная станция, г. Кострома, Россия Брусника Vaccinium vitis-idaea L. издавна пользуется большой популярностью благодаря своим пищевым и лечебным свойствам. Ягоды брусники хороши как в свежем, так и в переработанном виде. В медицине свежие ягоды, брусничный сок и отвары сухих плодов рекомендуют при повышенном артериальном давлении, простуде, ревматизме, подагре, авитаминозах, а листья – как...»

«В практику педиатра Л.П. Мазитова, Л.К. Асламазян, Л.Л. Квачахия, Л.С. Намазова Научный центр здоровья детей РАМН, Москва Патогенетическое обоснование местной терапии акне в подростковом возрасте В СТАТЬЕ РАССМАТРИВАЮТСЯ РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ УГРЕВОЙ БОЛЕЗНИ, ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ, А ТАКЖЕ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ЕЕ ЛЕЧЕНИЯ. ПРЕДСТАВЛЕНЫ РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ, СВИДЕТЕЛЬ СТВУЮЩИЕ О ВЫСОКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ТОПИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ АДАПАЛЕ НОМ И БЕНЗОИЛА ПЕРОКСИДОМ ПРИ...»





Загрузка...


 
2016 www.os.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Научные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.