WWW.OS.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Научные публикации
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

«С.Л. РАСТОРГУЕВ КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВЫХ РАСТЕНИЙ Мичуринск – наукоград РФ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Министерство сельского хозяйства РФ

Федеральное государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Мичуринский государственный аграрный университет»

С.Л. РАСТОРГУЕВ

КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ

И ОРГАНОВ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВЫХ

РАСТЕНИЙ

Мичуринск – наукоград РФ

Печатается по решению

УДК 634.1:631.527:58.085

редакционно-издательского совета ББК 42.35-31 Мичуринского государственного Р24 аграрного университета

Рецензенты:

И.П. Хаустович д.с.-х. наук, ведущий научный сотрудник ВНИИС им. И.В.Мичурина В.Ф. Палфитов д. с.-х. наук, профессор кафедры химии Мичуринского государственного аграрного университета Р24 Расторгуев, С.Л.

Культура изолированных тканей и органов в селекции плодовых растений: Монография / С.Л. Расторгуев – Мичуринск : изд-во Мичуринского государственного аграрного университета, 2009. – 170 с.

ISBN 978-5-94664-162-3 В последнее время быстрыми темпами развивается клеточная инженерия, важнейшими методами которой являются: эмбриокультура, индукция сомаклонов, клеточная селекция на устойчивость к стрессорам, клональное микроразмножение и др.

При практическом использовании клеточных технологий в селекции, возникает объективная необходимость в разработке новых, более эффективных приемов регенерации растений. Решение этой проблемы позволит расширить границы применения тканевых культур для повышения интенсификации селекционного процесса.

В монографии излагаются экспериментальные данные по культивированию изолированных тканей и органов плодовых и ягодных растений для целей селекции. Рассмотрены практические вопросы индукции морфогенеза in vitro и приемы повышения регенерационной способности изолированных тканей. Уделено внимание анализу изменчивости растений – регенерантов и методическим вопросам тканевой селекции.

Книга предназначена для научных сотрудников, аспирантов и студентов биологических и агрономических высших учебных заведений.

УДК 634.1:631.527:58.085 ББК 42.35-31 ISBN 978-5-94664-162-3 © Расторгуев С.Л., 2009 ©Издательство ФГОУ ВПО « Мичуринский государственный аграрный университет», 2009

СОДЕРЖАНИЕ

Введение ……………………………………………………………… 4 Глава 1. Перспективы использования методов культуры изолированных клеток, тканей и органов в селекционной практике …………………………………………………………………… 8

1.1. Развитие и становление методов клеточных и тканевых культур растений ………………………………………………………….. 8

1.2. Клеточные технологии в решении селекционных проблем ………………………………………………. 22 Глава 2. Метод эмбриокультуры в повышении эффективности селекционного процесса некоторых плодовых растений … 31

2.1. Культура изолированных зародышей в получении сеянцев отдаленных гибридов сливы разной степени стерильности ………… 31

2.2. Влияние физиологически активных веществ на развитие изолированных зародышей яблони в культуре in vitro………………. 57 Глава 3. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции земляники ………………………………… 67

3.1. Индукция и культивирование каллусной ткани, анатомические и ультраструктурные особенности клеток каллуса ………... 68

3.2. Морфогенез адвентивных побегов из каллуса ………………… 73

3.3. Регенерация придаточных побегов непосредственно из исходных эксплантов ………………………………………………………. 83

3.4. Тиражирование и укоренение побегов, полученных в культуре каллусных и листовых тканей ………………………….. 91 3.4.1. Оптимизация приемов технологии ускоренного размножения in vitro …………………………………………………….. 95

3.5. Анализ изменчивости растений-регенерантов ………………… 102 Глава 4. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции малины ……………………………………. 108

4.1. Клональное микроразмножение сортов – доноров, источников эксплантов …………………………………………………………….. 119

4.2. Индукция и культивирование каллусной ткани, цитогенетические особенности клеток каллуса …………………………………… 111

4.3. Морфогенез в культуре каллусной ткани ……………………… 116

4.4. Регенерация растений непосредственно из исходных эксплантов ……………………………………………………………………... 124

4.5. Селекция тканевых культур, резистентных к солевому стрессу 130 Глава 5. Экономическая эффективность производства рассады земляники с использованием культуры изолированных тканей ………………………………………………………………… 136 Заключение …………………………………………………………… 139 Список литературы …………………………………………………... 142

ВВЕДЕНИЕ

Быстрые темпы роста населения Земного шара вызывают необходимость значительного увеличения производства продуктов питания, учитывая при этом, что в настоящее время в мире насчитывается примерно 1,5 млрд. голодающих людей. Известно, что около 93 % пищи человека составляют продукты растениеводческих отраслей, одной из которых является садоводство. Для решения проблемы продовольственной безопасности стран необходимо существенное повышение урожайности и улучшение качества основных сельскохозяйственных растений, в том числе, плодовых и ягодных культур.

В современных условиях ухудшающейся экологической обстановки возникает другая проблема - качественное, рациональное питание человека, обеспечивающее его здоровье и долголетие. Рацион человека должен в обязательном порядке содержать в необходимом количестве биологически активные природные вещества антиоксидантного действия, повышающие устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды и, как следствие, сдерживающие старение организма и поражение его болезнями (Гудковский,2000).

В связи с этим, плоды и ягоды садовых растений являются наиболее ценными и незаменимыми источниками витаминов, органических кислот, легкоусвояемых сахаров, макро- и микроэлементов и других биологически активных веществ, которые обладают профилактическими и лечебными свойствами. По разработанным медицинским нормам годовая потребность человека в плодах и ягодах в нашей стране должна составлять 100-120кг, фактически производится лишь 18-20кг, что явно недостаточно для нормальной жизнедеятельности организма.

Интенсификация садоводства, направленная на увеличение производства высококачественных плодов и ягод, предъявляет высокие требования к сортовому составу. Сорта должны обладать совокупностью устойчивых хозяйственно ценных признаков. Меж тем, все возрастающая нестабильность климата приводит к тому, что существующий набор сортов нуждается в значительном пополнении или даже замене. Важная роль в совершенствовании сортимента, а следовательно, и в повышении продуктивности и экономической эффективности плодовых насаждений отводится селекционному улучшению сортов. Прирост урожайности у сортов за счет селекции может достичь 30-70% и роль этого фактора, в частности, в садоводстве, будет постоянно возрастать в связи с инерционностью сортового состава, необходимостью перехода к низкозатратным, экологически безопасным технологиям (Жученко, 2001).

К настоящему времени селекционерами достигнуты определенные успехи по созданию новых высокопродуктивных сортов плодовых и ягодных культур. Вместе с тем, не все из существующих сортов в полной мере отвечают возрастающим современным требованиям. Попытки улучшить сортимент на основе внутривидовой гибридизации не всегда приводят к желаемым результатам.

В решении задач по выведению высокопродуктивных, скороплодных сортов плодовых растений, с высоким потенциалом адаптации к экстремальным факторам внешней среды и ценным биохимическим составом плодов важное место принадлежит отдаленной гибридизации. По мнению Н.И. Вавилова (1960) Н.В. Цицина (1978) и других ученых, в методе отдаленной гибридизации заложены огромные потенциальные возможности, которые позволяют решать теоретические, прикладные и методические вопросы селекции и создания на базе этого новых хозяйственно ценных форм и сортов, более полно удовлетворяющих запросы производства.

И.В. Мичурин (1948) придавал важное значение межвидовым и межродовым скрещиваниям, как эффективным и действенным приемам в создании « …совершенно новых видов плодовых растений с еще небывалыми формами и свойствами ». Метод отдаленной гибридизации позволяет конструировать новые генотипы, объединяющие наследственные факторы разных видов и родов, что способствует получению ценного исходного материала для целей селекции.

Процесс создания сортов традиционными методами довольно длительный. Так, на получение нового сорта малины с учетом всех этапов его формирования требуется 10-12 лет (Казаков, 2004), косточковых культур и более лет, при отдаленной гибридизации эти сроки еще увеличиваются.

В настоящее время для совершенствования традиционного селекционного процесса, в том чиле отдаленной гибридизации, важное значение приобретает использование высоких технологий, которые основаны на культивировании в системе in vitro клеток, тканей и органов растений и направленных на сокращение сроков создания ценных генотипов.

Клеточные технологии в селекционной работе можно разделить на две группы:

1) облегчающие и ускоряющие традиционный процесс; 2) создающие генетическое разнообразие и скрининг генотипов с ценными признаками (Бутенко, 1986).

Важнейшими методами клеточной инженерии в получении нового исходного селекционного материала являются: эмбриокультура, индукция сомаклональных вариантов, тканевая селекция на устойчивость к срессорам, клональное микроразмножение отобранных в ходе селекции особо ценных элитных форм и др.

С помощью культуры зародышей можно существенно повысить эффективность инконгруэнтных скрещиваний. Культивирование незрелых зародышей используется в том случае, когда невозможно, получить определенную комбинацию признаков в одном генотипе традиционными методами селекции. В ряде случаев возникает необходимость получения F2 отдаленных гибридов, формирующих маложизнеспособные семена, которые в обычных условиях не прорастают. Вызывает интерес возможность тиражирования и сохранения ценных генотипов за счет получения от каждого зародыша нескольких дополнительных побегов, что особенно важно в работе по отдаленной гибридизации. Однако ряд методических вопросов практического выращивания сеянцев в культуре изолированных зародышей плодовых растений разработан ещё недостаточно. По сравнению с обычными приемами получения сеянцев эмбриокультура снижает риск потери селекционно-ценных генотипов, т.к. процесс их выращивания протекает в контролируемых условиях.

При культивировании соматических тканей в условиях in vitro можно получать растения - сомаклоны, которые отличаются определенными фено- и генотипическими признаками от исходных форм. В сомаклональных вариантах наблюдается изменение не только моногенных, но и полигенных признаков. Было установлено, что использование сомаклонов может в два раза ускорить процесс создания нового сорта (Evans et al., 1984).

Метод тканевой селекции позволяет целенаправленно проводить в жестких селективных условиях скрининг стабильных каллусных линий, а затем и растений – регенерантов с повышенной резистентностью к конкретным абиотическим и биотическим стрессорам.

Клональное микроразмножение аналогично вегетативному способу размножения и различается лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro, где из эксплантов определенного типа можно ускоренно получать достаточно большое количество растений, идентичных исходному экземпляру. Хотя технология ускоренного размножения многих растений разработана достаточно хорошо, сведения отностительно техники клонального микроразмножения важных плодовых и ягодных культур далеко не полны. Поэтому этот прием имеет тенденцию к усовершенствованию отдельных этапов применительно к конкретным генотипам.

Несмотря на несомненную перспективность клеточных технологий, главная проблема, возникающая при практическом использовании культуры изолированных тканей и органов в селекционном процессе, заключается в разработке эффективных приемов надежного получения растенийрегенерантов из эксплантов различного происхождения. Изучению этого вопроса посвящен ряд работ отечественных и зарубежных авторов, что свидетельствует о большом значении проблемы регенерации для всей методологии культуры ткани, без решения которой становятся бесполезными исследования по культивированию тканей и органов in vitro для целей селекции. Способы индукции морфогенеза растений универсальны лишь только в общих закономерностях, поэтому хорошо разработанная система регенерации для конкретного генотипа не всегда подходит для других клонов данного вида и тем более представителей других видов.

На реализацию морфогенетического потенциала клеток и тканей оказывают влияние ряд факторов - внешние (химический и гормональный баланс питательной среды, физические условия культивирования) и внутренние (генотип растения- донора, его возраст, тип и физиологическое состояние экспланта). Все это необходимо учитывать при поиске оптимальных условий регенерации растений из соматических тканей при разработке базовых технологий. Однако сложность данной проблемы заключается в том, что морфогенетические потенции многолетних плодовых растений намного слабее по сравнению с однолетними культурами и поэтому труднее индуцировать регенеранты из изолированных тканей. Отсюда и небольшое количество работ по плодовым культурам, что свидетельствует об актуальности решения проблемы. Совершенствование приемов стабильного получения растений-регенерантов позволит шире использовать методы культуры изолированных тканей и органов в создании исходного материала для селекции плодовых и ягодных растений.

В связи с этим представленные результаты исследований посвящены разработке приемов культивирования изолированных тканей и органов в решении проблемы повышения эффективности отдаленной гибридизации и совершенствования селекционного процесса плодовых и ягодных культур.

Некоторые экспериментальные исследования выполнены с Тюленевым В.М., Нафталиевым П.М., Осиповой Л.В., Туровским И.И., Поляковым С.А., Верзилиным А.В. за что автор выражаем им искреннюю благодарность. Особая признательность академику РАСХН, доктору сельскохозяйственных наук, профессору Савельеву Н.И. за ценные советы и предложения при выполнении работы.

ГЛАВА 1. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ

КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ

В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ

1.1. РАЗВИТИЕ И СТАНОВЛЕНИЕ МЕТОДОВ КЛЕТОЧНЫХ

И ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР РАСТЕНИЙ

Проблема питания – одна из первоочередных проблем человечества, требующая скорейшего решения. Из этого следует, что повышение продуктивности растениеводства – необходимое условие увеличения производства продовольствия.

Во второй половине XX столетия улучшение важнейших культурных растений, как по урожайности, так и по качеству стремились решать за счет химизации, мелиорации и механизации сельскохозяйственного производства. Это в свою очередь привело к загрязнению окружающей среды, засолению и эрозии почв, уплотнению и нарушению структуры пахотного слоя, удорожанию единицы продукции и др.

Важная роль в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений и особенно в условиях изменяющегося климата, ухудшающейся экологической обстановки принадлежит селекционному улучшению сортов. Однако, процесс создания принципиально новых сортов традиционными методами довольно длительный, и результатов приходится ждать не один год. Вместе с тем, улучшение важнейших сельскохозяйственных культур с использованием только классических методов селекции и генетики в ряде случаев не приносит должного эффекта.

В.С. Шевелуха (2003) отмечает, что попытки селекционеров создать комплексно устойчивые и урожайные сорта и гибриды с помощью этих методов не привели к желаемым результатам. Использование трансгрессивной селекции, основанной на отдаленной гибридизации, дало возможность решить ряд частных проблем повышения продуктивности культурных растений, в том числе устойчивости к стрессовым факторам окружающей среды. Поэтому крайне важен поиск новых, эффективных направлений, которые в перспективе позволили бы не только повысить урожай и качество культурных растений, но и были бы низкозатратными, экологически безопасными для растениеводства. В настоящее время одним из таких подходов является сельскохозяйственная биотехнология.

В растениеводстве до недавнего времени наблюдалось определенное отставание в использовании достижений биотехнологии. В последние годы, благодаря появлению новых методов, это направление стало одним из наиболее быстроразвивающихся, и во многих странах мира сельскохозяйственной биотехнологии придается первостепенное значение. Особенно перспективным для растениеводства представляется возможность получения высокопродуктивных генотипов растений с улучшенными показателями качества продукции и устойчивости к действию неблагоприятных абиотических и биотических стрессоров.

Не так давно большие надежды в решении проблемы производства продуктов питания для всего населения связывали с так называемой «зеленой революцией» (Харченко, Глазко, 2006). Однако сейчас этот энтузиазм переносится в область использования современных биотехнологических методов, что позволяет некоторым ученым говорить о второй «зеленой революции». И это особенно актуально сейчас, в XXI столетии, когда человечество вступило в эру биологии (Жученко, 2006).

В отличие от клеток животных, растительные клетки обладают значительным преимуществом – способностью в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целые растения, что связано с явлением тотипотентности. В связи с этим одним из основных направлений сельскохозяйственной биотехнологии является клеточная инженерия растений, которая возникла в 50-е годы прошлого века. В основе клеточной инженерии лежит метод культивирования клеток, тканей и органов растений. Под этим методом принято понимать выращивание in vitro изолированных клеток, различных тканей, частей и органов растительного происхождения в стерильных, строго контролируемых условиях.

Метод культуры клеток и тканей был разработан в сравнительно короткое время и теперь интенсивно развивается и внедряется в различные отрасли науки и практики. По общему мнению, специалистов, вклад достижений клеточной инженерии в развитие современного растениеводства, которое немыслимо без поступательного развития селекции, с каждым годом все возрастает, что отражено в ряде научных статей и монографий (Morel, 1959; Cocking, 1960; Jones, 1973; Jones,1974; Boxus, 1974, 1977; Бутенко, 1979, 1986, 1990; Lane, 1979; Рингерц, Сэвидж, 179; Лейке и др., 1980;

Ницше, Венцель, 1980; Овчинников, 1982; Evans et al., 1984; Шевелуха, 1986, 1993, 2003; Брайт и др., 1987; Джонс, 1987; Хасси, 1987; Атанасов, 1988; Артамонов, 1989; Картель, 1989; Трофинец, 1991; Высоцкий, 2000;

Жученко, 2006 и др.).

Наиболее ранними работами, в которых сделаны первые попытки выращивать изолированные от растения ткани, были исследования, проведенные немецкими учеными H. Vochting, C. Rechinger, G. Haberlandt в период с 1892 по 1902 годы.

H. Vochting делил растения на все более и более мелкие части и культивировал их в растворе сахарозы с целью изучения явления полярности. Он показал, что полярность – это свойство, которое присуще каждому фрагменту ткани (независимо от его размера), а, следовательно, и отдельным клеткам растений.

Первым экспериментатором, поставившим опыты по определению «минимального предела» делимости растительных тканей, был С.Rechinger. Он помещал сегменты стеблей ясеня и тополя, корней свеклы и турнепса не на питательную среду, а на поверхность влажного песка, т.е.

без соблюдений условий асептики. Автор пришел к заключению, что ткани размером менее 20мм иногда были способны продуцировать каллус и даже почки. С уменьшением толщины среза эта способность падала, и экспланты тоньше 1,5мм не росли.

G. Haberlandt (1902) поставил опыты, где в качестве объектов изучения использовал группы специализированных клеток: клетки палисадной паренхимы листьев яснотки и сердцевины черешков водного гиацинта, тычиночные нити традесканции, железистые и жгучие волоски медуницы и крапивы, замыкающие клетки устьиц лилейных. Он считал, что при выращивании клеток, содержащих зеленый пигмент хлорофилл, отпадает необходимость добавления в питательную среду источника углерода, так как такие ассимилирующие зеленые клетки сами обеспечат свой рост в условиях in vitro. Ho G. Haberlandt не принял во внимание тот факт, что подобные клетки являются специализированными и полностью дифференцированными, потерявшими способность к делению и росту. Способа стимулировать дедифференциацию клеток он не нашел, что было обусловлено отсутствием в питательной среде регуляторов роста, способных вызывать клеточные деления. В этот период ученые еще не сформулировали концепцию о ростовых гормонах и не были открыты известные классы регуляторов роста. Поэтому результаты опытов во всех случаях оказались неудачными, клетки не росли и не давали новообразований в культуре.

Экспериментальные исследования, проведенные H. Vochting, С.Rechinger, G. Haberlandt явились отправной точкой для дальнейшей разработки метода культуры изолированных клеток и тканей как растений, так и животных. После работ этих исследователей предпринимались многочисленные попытки подобрать подходящую питательную среду и создать благоприятные условия для выращивания изолированных от целого растения органов, тканей и клеток. В качестве растительных объектов были использованы фрагменты специализированных (лист, корень) и эмбрионально-активных тканей (корешки и гипокотили молодых проростков). Однако по-прежнему деления клеток и новообразования тканей экспериментаторы не наблюдали, что стало причиной потери на некоторое время интереса к разработке метода культуры тканей растительного происхождения.

Именно в этот период возникло и успешно развивалось учение о культуре животных тканей. За довольно короткий срок, с 1907 по 1913 годы, была успешно разработана основа метода культивирования тканей животного происхождения на питательной среде, содержащей кровяную плазму и зародышевую жидкость или их заменители.

Поэтому, ботаники вновь предприняли попытки продолжить разработку метода культуры тканей и выращивания растительных объектов по аналогии на естественных питательных средах, содержащих растительные экстракты (Czech, 1926). Но эти эксперименты имели отрицательный результат, в виду того, что ученые при культивировании in vitro использовали среды неопределенного состава (содержимое проводящих элементов ксилемы, экстракт из листьев, эскудат флоэмы, жидкость эндосперма) и мало подходящие для проявления ростовой активности экспланты, в которых клетки были высоко специализированными.

Вытяжки из растительных объектов не могли служить достаточной питательной средой для культивирования in vitro клеток и тканей. Эти обстоятельства побудили исследователей, работавших в области культуры растительных тканей, обратить свое внимание на создание синтетических питательных сред необходимого состава. До этого момента применяемые питательные среды отличались примитивным составом и в основном были представлены раствором минеральных солей по прописи Кнопа. Указанный питательный раствор был разработан для выращивания целых растений, а не для культивирования растительных тканей.

Тенденция перехода от естественных сред и минеральных растворов к разработке синтетических, более сложных по составу питательных сред со всеми необходимыми компонентами, дала свои положительные результаты при выращивании in vitro растительных объектов. Эти позитивные направления в развитии метода культуры тканей растений подтвердили независимо друг от друга W. Kotte (1922) в Германии и W.J. Robbins (1922) в США, получив при этом близкие результаты. Прежде всего, они обратили внимание на выбор объектов изучения. В качестве эксплантов для культивирования были использованы меристемы кончиков корней гороха и кукурузы, длиной примерно 1мм. Клетки тканей кончиков корней являлись эмбрионально активными, не утратившими способность к митотическому делению и росту.

Питательная среда, применяемая W. Kotte, представляла собой разбавленный раствор минеральных солей по прописи Кнопа, к которому добавляли различные смеси, содержащие глюкозу (1%), аминокислоты (аспарагин, аланин, глицин), мясной экстракт Либиха (5г/л), экстракт из муки гороха. На такой синтетической среде изолированные корни достаточно хорошо росли, увеличивались в длину, но этот процесс протекал в течение всего лишь 12 дней со дня помещения в условия in vitro. W. J. Robbins заменил мясной экстракт Либиха на дрожжевой экстракт и примененил прием пересева (пассирования) эксплантов на свежие питательные среды.

W.J. Robbins (1922а), удалось поддерживать культуру уже более длительное время – 20 недель. Аналогичные результаты были получены N.Malyscev (1932).

Следовательно, W. Kotte и W.J. Robbins получили первые реальные результаты в разработке метода культуры растительных клеток и тканей.

Одним из важных этапов этой работы были исследования по усовершенствованию синтетических питательных сред за счет добавления в их состав различных компонентов (сахаров, отдельных аминокислот, вытяжек из дрожжей и т.д.). В этот период E.E. Uspenski, W.J. Uspenski (1925) создали питательную среду для культивирования водорослей, в частности, вольвокса, которая была использована некоторыми исследователями для выращивания изолированных меристематических тканей корней.

Начало успешному развитию метода культуры тканей высших растений, когда он стал приобретать современные черты, положили исследования, проведенные P.R. White (Ф. Р. Уайт) в США и R. J. Gautheret (P. Готре) во Франции. Работы по культивированию растительных объектов в условиях in vitro ими были начаты в начале тридцатых годов прошлого века.

Заслуга этих ученых в разработке метода культуры растительных клеток и тканей заключалась в том, что ими были экспериментально воспроизведены идеи и принципы, высказанные еще G. Haberlandt, путем выбора «удобных» объектов исследований и создания соответствующих питательных сред (Gautheret, 1932; White, 1933). В качестве исходных эксплантов для опытов были использованы изолированные кончики корней, каллусные ткани древесных и травянистых растений камбиального происхождения, запасающая паренхима корнеплодов и клубней.

Исследованиями, выполненными P.R. White и R.J. Gautheret, впервые была показана возможность длительного выращивания in vitro тканей различного происхождения. Так работами P.R.White (1932, 1934) установлено, что изолированные корневые меристемы томатов могут расти в культуре практически неограниченно долго. Аналогичные результаты в опытах с изолированными корнями получили M J. Bonner, F. Addicott (1937), G.C. Galligar (1939) и др. Эксперименты, поставленные R.J. Gautheret (1934, 1940), P.R. White (1939) и другими учеными, подтвердили способность недифференцированных растительных тканей (каллус камбиального происхождения) к продолжительному росту в асептических условиях. Кроме того, P.R. White (1939а) была показана возможность заложения почек, образования стеблей и листьев из культуры каллусной ткани табака, что явилось частичным подтверждением положения тотипотентности растительной клетки.

Заслуживают внимания работы R. J. Gautheret (1959) и Ф.Уайта (1949), которые внесли значительный вклад в разработку первых полностью синтетических питательных сред для культуры растительных тканей.

За основу для создания сред они взяли уже известные питательные растворы, которые использовались для опытов по выращиванию целых растений - питательную смесь Кнопа и раствор Успенских. В эти растворы были добавлены сахара, микроэлементы, витамины. Так, R.J.Gautheret уменьшил в два раза концентрацию минеральных солей в растворе Кнопа, заменил жидкую среду на твердую путем добавления уплотняющих соединений – полисахарида растительного происхождения - агара. Ф.Уайт модифицировал среду Успенских за счет расширения состава минеральных веществ и изменил их концентрации, в частности, дополнил среду витаминами (никотиновая кислота, пиридоксин). Разработанные этими авторами составы питательных сред применяются и в настоящее время для выращивания многих культур, в том числе тканей картофеля, моркови, табака, винограда и других растений.

Установлено, что обязательными компонентами питательных сред являются источники минерального питания (смесь солей различных макрои микроэлементов), углеродного питания в виде различных сахаров (моноди- и полисахаридов) и наличие биологически активных веществ (витаминов, фитогормонов и др.), играющих роль в регуляции процессов клеточного деления, ди- и дедифференциации.

Для совершенствования и поиска оптимальных условий культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений ряд исследователей изучали влияние различных компонентов питательной среды на этот процесс. D.I. Arnon (1938), L.G. Nickell, P.K. Burkholder (1950), R. Heller (1953, 1955), H.E. Street (1957), F.S. Steward et al. (1958), R.M. Klein et al (1962), Р.Г. Бутенко (1964), P.A. Sargent, J. King (1974), O.L. Gamborg et al.

(1976), T. Wellander (1976) и другие исследовали действие макро- и микроэлементов для поддержания ростовой активности тканей в условиях in vitro. A.C. Hildebrandt, A.J. Riker (1953), E. Ball (1955), J.P. Nitsch, C. Nitsch (1956), R.J. Gautheret (1959), L.G. Nickell, A.Maretzki (1970), С.А. Сафразбенян и др. (1991) выявили потребность тканевых культур в источниках углеродного питания. В ряде работ было рассмотрено значение витаминов и других физиологически активных веществ в составе питательных сред (Bonner, 1938; Morel, 1946; Henderson 1954; Paris, 1958; Бутенко, Баскаков, 1960; Козлова, 1962; Калинин и др., 1980).

Важнейшая роль среди физиологически активных веществ принадлежит регуляторам роста ауксиновой и цитокининовой природы, их концентрациям и соотношениям, в которых они включаются в состав питательной среды. Содержание регуляторов роста обычно является определяющим фактором для успешного выращивания культур клеток и тканей, но при этом оптимум концентраций ауксинов и цитокининов, необходимых для нормального роста и развития эксплантов, у разных видов может варьировать.

Первые сообщения о способности природного ауксина индолил –3 – уксусной кислоты (ИУК) вызывать длительную пролиферацию в изолированной культуре растительных тканей сделали P.R. White (1939) и R.J. Gautheret (1939). В.И. Кефели (1973), К.З.Гамбург (1976), К.З. Гамбург и др. (1990) установили, что ауксины принимают участие в регуляции не только растяжения клеток, но также и их деления, в частности, при стимуляции образования корней и каллуса, при активации камбия. Этим обусловлено их непременное включение в состав питательных сред для использования в качестве важнейшего компонента управления ростом и морфогенезом тканевых культур in vitro (Thimann, Skoog, 1940; Steward, Caplin, 1951; Nitsch, Nitsch,1956; Pilet, 1961; Mullin, 1970; Гамбург и др., 1972 и др. Однако было отмечено, что индукция длительно пролиферирующих культур растительных клеток и тканей с помощью одной ИУК или ее аналогов не всегда удается. Важное значение в развитии представлений о характере регуляции деления клеток и индукции морфогенеза имели исследования, приведшие к открытию цитокинина (кинетина) (Miller et al, 1955), а в дальнейшем - к синтезу более активных аналогов цитокининов (Skoog et al., 1967). Основной физиологический эффект цитокининов при введении их в состав питательной среды заключается в активации размножения клеток, а также в стимулировании роста клеток листьев и семядолей, снятии апикального доминирования и т.д. (Morel, 1959;

Бутенко, 1960; Adamson, 1962; Lustinec et al, 1962 и др.). Значительную роль цитокинины играют в регуляции процесса органогенеза in vitro (Skoog, Miller, 1957; Кефели, 1973).

Было показано, что клеточное деление в изолированной культуре довольно часто индуцируется за счет взаимодействия представителей двух классов экзогенных регуляторов роста – ауксинов и цитокининов (Miller et al, 1955; Galston, Chen, 1965; Дмитриева, Липский, 1973 и др.). На основании полученных экспериментальных данных, F.Skoog, C.O. Miller (1957) установили, что изменяя соотношение аналогов ауксинов и цитокининов в питательной среде, можно управлять процессами морфогенеза в тканевых культурах. Преобладание ауксинов стимулирует образование корней, а цитокининов - почек, листьев и стеблей. Рост недифференцированной каллусной ткани происходит при примерно равном соотношении этих ростовых гормонов.

В состав некоторых питательных сред вводят гиббереллины (гибберелловую кислоту). Однако в большинстве случаев они не являются непременными компонентами питательных сред для культур растительных тканей и клеток. Физиологическое действие этой группы фитогормонов проявляется, главным образом, в стимуляции ростовых процессов за счет усиления растяжения клеток и повышения митотической активности меристематической ткани (Кефели, 1973). Экспериментальными работами Р.Г. Бутенко и др. (1961), J. Bruinsma (1967), Г.Б. Максимова и др. (1970), G. Dallessandro (1973), B.D. Singh et al (1974), S.C. Fry, H.E. Street (1980), Г.С. Муромцева, В.Н. Агнестиковой (1984) установлено, что в зависимости от условий культивирования и того, какие культуры тканей использованы в опытах, могут наблюдаться самые различные эффекты гиббереллинов.

От отсутствия влияния, торможения или стимуляции деления клеток, до стимуляции их растяжения. Поэтому, в ряде случаев гиббереллины наряду с ауксинами и цитокининами являются важными компонентами среды как фактор регуляции поведения клеток и их метаболизма в изолированной культуре.

На основании информации о влиянии отдельных компонентов питательной среды на рост и развитие культивируемых клеток и тканей растений продолжался поиск наиболее оптимальных составов питательных сред применительно к отдельному опытному объекту или группе близко родственных объектов, а также поставленным задачам. К настоящему времени усилиями ученых разработано свыше ста различных по составу и другим свойствам питательных сред. При этом значительное количество искусственных питательных сред, используемых в исследованиях методом культуры тканей, являются разнообразными модификациями стандартных прописей.

В создание комплексных синтетических питательных сред для выращивания эксплантов различных культур внесли значительный вклад:

С. Nitsch (1951), R. Heller (1953), J. K. Vasil (1959), T. Murashige, F.Skoog (1962), C.O. Miller (1963), G. Morel, J.F. Muller (1964), E.M. Linsmair, F. Skoog (1965), G.P. Gupta et al. (1966), O.L. Gamborg, D.E. Eveligh (1968), А.С. Смирнов (1970), R.U. Schenk, A.C. Hildebrandt (1972), K.N. Kao, M.R. Michayluk (1975), З.Б. Шамина, Р.Г. Бутенко (1976) и др.

Оказалось, что эти комплексные питательные среды приспособлены не только для частных случаев культивируемых растительных объектов, но и для решения более широкого круга вопросов, связанных с тканевыми культурами различного происхождения. Например, по данным Р.А. Диксон (1989), Б. Тиссера (1989), Р.Г. Бутенко (1990) среда Т. Murashige, F. Skoog является наиболее уникальной и многоцелевой средой, употребляемой в работе с культурами клеток растений многих видов. Она дает хорошие результаты при каллусогенезе у большинства растений, поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у значительного числа двудольных растений. Среда Ф.Уайт применяется не только для выращивания изолированных тканей, но и для укоренения побегов, развития зародышей и нормального роста стеблевой части после регенерации. Среда С. Nitsch рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников и исследования морфогенеза у злаков.

От правильно подобранных компонентов в составе питательной среды в значительной мере зависит успех выращивания клеток, тканей и органов для решения актуальных проблем современной биотехнологии растений. Поэтому разработке и усовершенствованию составов питательных сред уделялось и уделяется в настоящее время много внимания (Высоцкий, Олешко, 1985; Еникеев и др., 1986; Алешин и др., 1991; Крючкова и др., 2005). Скорее всего, совершенствование составов питательных сред будет продолжаться и в дальнейшем. Это связано с тем, что клетки и ткани разных растений растут и функционируют в совершенно различных метаболических условиях и поэтому, создание универсальной питательной среды проблематично.

В зависимости от условий культивирования тканевые культуры растений растут по-разному. Интенсивность, продолжительность и тип освещения, температура, соотношение кислорода и углекислого газа, условия аэрации, осмотическое давление, величина рН среды, как и химический состав среды, играют важную роль для эффективности процесса выращивания культуры ткани (Bunning, Welt, 1954; Rier, Henderson, 1957; Бутенко, 1964; Gamborg et al., 1968; Катаева, Бутенко, 1983; Никитина, 1993;

Юрьева и др., 1993). Так, T. Murashige (1977), G. Hussey, A. Falavigna (1980) установили, что оптимум освещенности для образования побегов у большинства травянистых растений лежит в области 1000 люкс, а длина периода освещенности (фотопериода) составляет 16 часов. Изменение этих параметров оказывает негативное влияние на рост и развитие культуры ткани. При определении наиболее оптимального температурного режима выращивания клеток и тканей in vitro следует принимать во внимание температурные требования, характерные для данного вида растений in vivo (Fonnesbech, Fonnesbech, 1980). Для большинства растений зоны умеренного климата температура поддерживается в пределах 20 - 25 0С. Субтропические растения лучше растут при температуре 29 - 30 0С.

Вышеперечисленные исследования и ряд других, подготовили базу и дали возможность выращивать в культуре in vitro практически любую живую ткань, состоящую из клеток с разным уровнем специализации, независимо от вида растений, из которых она получена. Но при этом необходимо помнить, что различные виды растений по-разному реагируют на сходные химические и физические условия культивирования. Подобные артефакты неизбежно приводят к необходимости использовать эмпирические подходы к подбору соответствующих условий культивирования для видов и даже сортов растений.

Ключевым моментом в использовании метода культуры клеток и тканей является индукция процесса морфогенеза и разработка эффективных систем регенерации (восстановления) целых растений из отдельных или группы клеток (Харченко, Глазко, 2006). Успех применения этого метода в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенерацию из них целых растений. Развитие растений – регенератов из органогенных или зародышеподобных структур, формирующихся при культивировании в системе in vitro, является наиболее важным условием эффективного применения метода культуры тканей в растениеводстве и, в том числе, для решения селекционно-генетических проблем. Без экспериментально вызванного морфогенеза и регенерации in vitro становятся бесполезными исследования по индукции генетически измененных растений, получению гаплоидов, быстрому размножению ценных и трудноразмножаемых генотипов растений, а также решению ряда других вопросов на основе применения методов клеточной инженерии.

Согласно результатам проведенных биотехнологических исследований, на реализацию морфогенетических потенций культивируемых клеток и тканей оказывают влияние ряд факторов (Murashige, 1974; Pierik, Steegmans, 1976; Бутова, Табацкая, 1979; Кучеренко, Мамаева, 1980; Мезенцев, Карелина, 1982; Катаева, Бутенко, 1983; Гапоненко и др., 1984;

Аветисов, Мелик-Саркисов, 1985; Dodds, Roberts, 1985; Бутенко и др., 1986; Дорсиев и др., 1991; Диас и др., 1993; Орлов, 1998; Лебедев и др., 2004).

Можно выделить две основные группы факторов: внутренние и внешние.

К внутренним факторам относятся: генотипическая характеристика вида и сорта растения - донора, его возраст, физиологическое состояние экспланта, его тип, размер и сезонность изоляции, а к внешним:

химический и гормональный баланс питательной среды, физические условия культивирования (консистенция среды, температура, интенсивность и качество освещения, фотопериод).

Анализ приведенных выше экспериментальных работ показывает, что из всех факторов, определяющих морфогенную способность изолированных тканей и органов, наибольшее значение имеет генотип растения- донора. Так, у эксплантов двудольных травянистых растений уровень регенерации выше, чем у эксплантов тех же типов, изолированных из однодольных и древесных растений. Предпочтительнее отбирать экспланты из здоровых, сильных растений, а также использовать для этих целей молодые, незрелые ткани и органы (ювенильный материал), т.к. они более пластичны с точки зрения способности к индукции морфогенеза в условиях in vitro. Большинство эксплантов лучше изолировать и вводить в культуру в фазе активного роста исходного растения. Целесообразно использовать гетерогенные экспланты (лист, черешок, стебель) ткани, которых состоят из клеток с измененным уровнем плоидности. Наличие таких клеток позволяет предполагать, что среди них могут быть клетки, более отзывчивые к компонентам питательной среды.

Существенное влияние на реализацию морфогенетического потенциала оказывают химический состав питательной среды и особенно ее гормональный баланс, а также ее физические свойства (жидкая или агаризованная). Типом органогенеза в культуре ткани можно управлять посредством индуктора, т.е. изменением концентрации и соотношений ауксинов и цитокининов в среде. Эту модель можно применить для тканевых культур многих растений, но в то же время она не может быть универсальной в силу ряда причин (специфичность исходного растения и экспланта, потребность в гормонах и другие факторы). Поэтому концентрация экзогенных фитогормонов, необходимых для регенерации целого растения, варьирует в широких пределах и для каждого вида определяется экспериментально.

Таким образом, изучение морфогенетического потенциала изолированных клеток и тканей и подбор оптимальных условий для его реализации способствует созданию базовых технологий, которые позволят стабильно получать растения – регенеранты. Методы регенерации растений in vitro относительно неплохо разработаны для однолетних и двулетних культур. Вместе с тем, механический перенос этих методов для применения на многолетних растениях не приводит к успеху, поскольку у этих пород намного ниже морфогенетические потенции и, следовательно, возникает трудность получения регенерантов.

Анализ накопленных данных по культуре клеток и тканей и проводимые в настоящее время исследования, возможно, в перспективе позволят создать универсальный метод реализации морфогенетических потенций in vitro.

Успешному решению ряда проблем, возникающих при регенерации, препятствует тот факт, что до сих пор не разработаны основы теории морфогенеза в искусственной культуре ни на клеточном, ни на молекулярном уровнях. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение клеточных и молекулярных механизмов морфогенеза в культуре клеток и тканей и лежащих в его основе процессов.

На основании проведенных опытов с культурой клеток и тканей in vitro ученые выдвинули ряд предположений (гипотез) о причинах перехода некоторых клеток неорганизованно растущих культур к формированию морфогенных структур.

Согласно теории гормональной регуляции, предложенной F. Skoog, C.O. Miller (1957), тип морфогенеза контролируется соотношением концентраций экзогенных стимуляторов роста ауксиновой и цитокининовой природы в среде. По предположению F.C. Steward (1958), процесс изолирования и культивирования клетки вне целостного растительного организма служит сигналом запуска регенерационных процессов и перехода ее к выполнению программы развития от соматической клетки до растения. Р.Г. Бутенко, З.М. Яковлева (1962) сообщают о предложенной ими гипотезе, о вероятностном характере морфогенетического процесса, который может начаться только в результате совпадения целого ряда обстоятельств. К ним относятся определяемый генетически уровень высокой или низкой способности к морфогенезу in vitro, эпигенетическое состояние клеток, компетентность конкретной культивируемой клетки принять сигнал к перестройке программы развития и ответить на него.

В результате взаимодействия детерминированных клеток, образовавшихся за счет деления инициальной перепрограммированной клетки, реализуется та или иная морфогенетическая программа развития.

Известно, что в культуре клеток может осуществляться реализация нескольких морфогенетических программ, а именно, через органогенез и эмбриогенез.F. Meins et al. (1980) установлено, что в культуре ткани табака под влиянием того или иного стимула только одна клетка из 1000 способна стать инициальной клеткой, вызывающей в дальнейшем регенерацию органогенных структур (почки, стебля, корня). Данные V. Hari (1980), касающиеся величины эмбриогенного потенциала культивируемых in vitro клеток, показывают, что из 103 – 104 клеток лишь одна клетка развивается в эмбриоид. Следовательно, эффективность реализации морфогенетических процессов по типу органогенеза значительно выше по сравнению с соматическим эмбриогенезом.

Н.А. Моисеева (1991), изучая клеточные механизмы морфогенеза в культуре ткани табака, поставила эксперименты по выяснению организации морфогенетических процессов во времени. По мнению автора временной интервал, в течение которого происходит индукция компетенции клеток, а затем детерминация каллусных клеток, участвующих в реализации программы стеблевого морфогенеза, является величиной постоянной, равной 9-12 дням. Аналогичные результаты были получены в исследованиях M.L. Christianson, D.A. Warnick (1984) на листовых тканях вьюнка полевого. Трансформация специализированных клеток в компетентные может наблюдаться в системах, вызывающий любой из трех органогенных процессов (стеблевой органогенез, ризогенез и каллусогенез).

Поэтому с достаточным основанием можно утверждать, что компетентные клетки являются единой морфогенетической единицей и адвентивного побега, и корня и каллусной ткани.

В литературе имеется информация о том, что при использовании эксплантов, состоящих из дифференцированных растительных клеток или клеток первичной каллусной ткани, в реализации программы стеблевого органогенеза принимают участие не все, а лишь определенный тип клеток (Tran Thanh Van, 1981; Flin et al., 1988). Так, установлено, что компетентными к действию экзогенных регуляторов роста являются эпидермальные и субэпидермальные клетки стеблевых эксплантов. Кроме того, получены данные о первоначальном количестве детерминированных клеток, необходимых для дальнейшей дифференцировки в адвентивные побеги ели (Flin et al., 1988) и соматические зародыши моркови (Nomura, Komamine, 1985), по-видимому, это 5-6 клеток.

Р.Г. Бутенко (1964) приводит данные, касающиеся требований к условиям осуществления процесса органогенеза на разных его фазах. В экспериментах была использована пассированная культура тканей табака и моркови. Фаза меристематизации и формирования стеблевой почки или эмбриоида вызывается внесением в питательную среду веществ цитокининовой природы (нуклеиновые соединения) и повышенной дозы смеси аминокислот. Роль этих веществ заключается в регуляции нуклеиновобелкового метаболизма каллусной ткани, что вызывает интенсивный синтез в клетках ДНК, РНК, белка и повышение отношения РНК/ДНК.

Нуклеиново - ауксиновый баланс ткани сдвигается в сторону увеличения содержания нуклеиновых компонентов, что приводит к закладке в каллусе регенерационной меристемы. Для перехода образовавшихся структур к активному росту органов (вторая фаза органогенеза) необходимо введение в состав среды или антиметаболистов нуклеинового обмена, или ауксиновых соединений. В клетках ткани экспланта при этом уменьшается количество РНК, падает содержание белка, уменьшается активность ауксиноксидозы (по сравнению с первой фазой), что ведет за собой повышение уровня ауксинов. Это приводит к выводу почечки и корешка из состояния своеобразного покоя, определяемого блокирующим действием очень высоких концентраций РНК и белка, и запускает механизм процесса регенерации целого растения. Приведенные результаты исследований совпадают с мнением других авторов (Thimann, Loos, 1957; Кулаева, Воробъева, 1962 и др.).

G.S. Hicks (1980), J.A. Smith et al. (1988), M.A. Toponi, M. Michele (1989) сообщают об изменениях, которые происходят в клетках на уровне ДНК, РНК и синтезируемых белков в связи с реализацией морфогенетического потенциала в культуре ткани. При индукции морфогенеза в каллусных клетках обычно появляются специфические белки-маркеры (Бутенко, Володарский, 1967).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

Похожие работы:

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 220.006.02 на базе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Р. Филиппова» Министерства сельского хозяйства РФ ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК Аттестационное дело № _ решение диссертационного совета от 23 апреля 2015 г № 2 о присуждении Елисеевой Людмиле Иннокентьевне, гражданке Российской Федерации, ученой степени доктора...»

«1 Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Библиотека К 80-летию ИрГСХА ТРУДЫ СОТРУДНИКОВ ИРКУТСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ АКАДЕМИИ Библиографический указатель (2009-2013 гг.) Иркутск 2014 УДК 016 ББК 91.3 Т 78 Печатается по решению научно-методического совета Иркутской государственной сельскохозяйственной академии Составители: Л. Ф. Мкртчян, Е. Т. Гутник Программное обеспечение АИБС ИРБИС: М. П. Чернакова Ответственный за выпуск : М. З. Ерохина Труды сотрудников...»

«mitragrup.ru тел: 8 (495) 532-32-82 ООО «Митра Групп»; Юр. Адрес: 129128, г. Москва, пр-д Кадомцева, д. 15, пом. III, ком. 18А; Факт. адрес: г. Москва, ул. Ленинская слобода, д.19, оф. 411; ОГРН: 1147746547673; ИНН: 7716775139; КПП: 771601001; Банк: Московский банк ОАО «Сбербанк России»; р/с: 40702810738000069116; к/с: 30101810400000000225; БИК: 044525225 ОТЧЕТ № 868255-Н об оценке рыночной стоимости земельного участка, общей площадью 180 000 кв. м, категория земель: сельскохозяйственного...»

«1 ОТЧЕТНЫЙ ДОКЛАД Главы Терсинского сельского поселения о проделанной работе Совета в 2014 году Добрый день, уважаемый Валерий Владимирович, односельчане и приглашенные! В соответствии с Федеральным законом Российской Федерации №131 – ФЗ «Об общих принципах организации местного самоуправления в Российской Федерации», на основании Устава муниципального образования Терсинское сельское поселение. Мы очередной раз собрались для того, чтобы проанализировать итоги прошедшего 2014, обсудить насущные...»

«Общество с ограниченной ответственностью «Сибирь»СХЕМА ВОДОСНАБЖЕНИЯ И ВОДООТВЕДЕНИЯ ПАРАБЕЛЬСКОГО СЕЛЬСКОГО ПОСЕЛЕНИЯ ПАРАБЕЛЬСКОГО РАЙОНА ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ НА ПЕРИОД С 2014 ДО 2024 ГОДА СПР-2014-064-ОМ Красноярск, 2014 Общество с ограниченной ответственностью «Сибирь» СХЕМА ВОДОСНАБЖЕНИЯ И ВОДООТВЕДЕНИЯ ПАРАБЕЛЬСКОГО СЕЛЬСКОГО ПОСЕЛЕНИЯ ПАРАБЕЛЬСКОГО РАЙОНА ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ НА ПЕРИОД С 2014 ДО 2024 ГОДА Директор А.В. Гриц Красноярск, 2014 Оглавление Общие положения Глава 1. Схема водоснабжения...»

«НАЖМИТДИН МУХИТДИНОВ Избранные труды в девяти томах Том пятый ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЗАКОНОДАТЕЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ НЕКОТОРЫХ ОТРАСЛЕЙ ПРАВА Алматы УДК 349.4 ББК 67.407 М92 Мухитдинов Нажмитдин М 92 Избранные труды в 9 томах. – Алматы, 2011. ISB 978-601-278-285-1 Т.5.: Теоретические и законодательные проблемы некоторых отраслей права. – Изд. 2-ое, доп. – 439 с. ISB 978-601-278478 7. Составители и ответственные редакторы: д.ю.н., профессор, член Союза писателей Казахстана Е.О.Алауханов; к.ю.н., доцент...»

«ДОПУСК К УЧАСТИЮ В БИРЖЕВЫХ ТОРГАХ 1.1. Заявитель предоставляет Агенту следующие документы: Для Юридических лиц, крестьянских (фермерских) хозяйств, индивидуальных предпринимателей: заявление на подтверждение статуса сельскохозяйственного товаропроизводителя (Приложение № 1) в 2 экз. (оригинал); копию информационного письма или уведомления о присвоении кодов статистики, в котором должны содержаться следующие виды деятельности Выращивание зерновых, технических и прочих сельскохозяйственных...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» Н.Н. Даричева, В.А. Ермолаев ТКАНЕВАЯ ТЕРАПИЯ В ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЕ Монография Ульяновск – 2011 ББК 48 УДК 619:616 085.36 Д 20 Даричева Н.Н., Ермолаев В.А Тканевая терапия в ветеринарной медицине. Монография. – Ульяновск, УГСХА 2011. – 168 с. ISBN 978-5-902532-75-0 Рецензент: доцент кафедры «Незаразные болезни» ЗападноКазахстанского аграрно-технического университета им....»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия»УТВЕРЖДАЮ: Проректор Белгородской ГСХА по научной работе _В.Ф. Ужик «_»_2009 г.УДК 631.171:633/635;631.172:632.31: 633/635;631.371:633/635 № госрегистрации 01200956436 Инв № ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ по теме «ЭКОНОМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭНЕРГОСБЕРЕЖЕНИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ (КРС)»...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ТВЕРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ А.Г. ГЛЕБОВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ КАК ФАКТОР ИННОВАЦИОННОГО РАЗВИТИЯ АПК Монография Тверь Тверская ГСХА УДК 631.152 (470.331) Г 40 Рецензенты: доктор экономических наук, профессор Ю.Т. Фаринюк доктор экономических наук, профессор А.В. Медведев Глебова А.Г. Г 40 Сельскохозяйственное консультирование как фактор инновационного развития АПК: монография / А.Г. Глебова – Тверь...»

«Сельское хозяйство 1. 631.303 Х 17 Халанский, В. М. Сельскохозяйственные машины : учеб. для вузов / В. М. Халанский, И. В. Горбачев. СПб. : Квадро, 2014. 624 с. 1651 р. Кол-во экземпляров: всего 50 2. 634 В 85 Всероссийский селекционно-технологический ин-т садоводства и питомниководства Россельхозакадемии. Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. тр. Т. ХХХX. Ч. 1. М. : ГНУ ВСТИСП, 2014. 382 с. ISBN 2073-4948 : 150 р. Кол-во экземпляров: всего 1 3. 634 П 55 Помология. В 5 т. Т. 5....»

«The Development of Science in the 21st Century: Natural and Technical Sciences. New York UDC/УДК 631.4 DOI: 10.17809/06(2015)-22 DIFFICULTIES IN ORGANIC FARMING: HOW TO OVERCOME THEM? Kozlov, Ye. M. Mogilev, Belarus ТРУДНОСТИ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ ЗЕМЛЕДЕЛИИ: КАК ИХ ПРЕОДОЛЕВАТЬ? Козлов Е.М. г. Могилев, Республика Беларусь The author approaches the term ecology in agriculРассмотрены принципы подхода к пониманию ture in details. Also, the author describea unique сущности термина «экология» в...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГБОУ ВПО Оренбургский ГАУ Положение об структурном подразделении 3.1 Управление персоналом Отдел делопроизводства и надзора за оборотом документации СМК-ПСП-04-01 УТВЕРЖДАЮ О ректор ФГБОУ ВПО Оренбургский ГАУ В.В. Каракулев «_» _ 20_ г. Н Н О ПОЛОЖЕНИЕ И об отделе делопроизводства и надзора АЦ за оборотом документации СМК-ПСП-04-01 РМ Версия 02 О Ф Н И Стр. 1 из 11 Версия: 02 Дата и время распечатки 31.03.2015 11:30 ФГБОУ ВПО Оренбургский...»

«Томский государственный университет Научная библиотека Информационная поддержка научных исследований и учебного процесса СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО Электронные ресурсы Краткий справочник www.lib.tsu.ru Томск 2009 Электронные ресурсы Научной библиотеки ТГУ предоставляются читателям бесплатно.Доступ к электронным ресурсам: локальные базы данных – с компьютеров сети Научной библиотеки ТГУ. полнотекстовые удаленные ресурсы – с компьютеров в сети ТГУ и Научной библиотеки ТГУ. реферативные и...»

«Бизнес-форум 1С:ERP 23 октября 2015 года Новое ERP-решение для повышения эффективности предприятий агропромышленного комплекса Гулянский Юрий генеральный директор ООО «Черноземье ИНТЕКО» 1С:ERP Агропромышленный комплекс 2 1С:ERP Агропромышленный комплекс 2 (1С:ERP АПК) новое отраслевое решение для предприятий агропромышленного комплекса России, разработанное на платформе 1С:ERP Управление предприятием 2. 1С:ERP АПК разработана проектной командой опытных специалистов, разработавших...»







 
2016 www.os.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Научные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.